165202. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növénylebontó enzim előállítására
165202 szerzők csak az oligogalakturonsavak és oldható pektinsavak hasításának folyamatát vizsgálták. Tekintettel arra, hogy ezek a szubsztrátumok mesterséges elszappanosítási termékek, míg a növényi sejtfalak természetes molekuláris hálózatában rögzített pektinanyagok metilészterek formájában vannak jelen, nem várható, hogy ez az enzim a természetes növényi anyagokkal szemben lebontó hatást fejt ki. Meglepő módon azt találtuk, hogy a Bacillus polymyxa szűrt tenyészeteiből elkülöníthető enzimek a növényi anyagokat, elsősorban a durván aprított főzelékféléket a bélrendszer fiziológiai körülményei között kiváló mértékben bontják le. Az enzimek aktivitása még nagy mennyiségű pancreas-enzim jelenlétében is teljes mértékben fennmarad. A Bacillus polymyxa-ból levezethető enzimek részletesebb vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a növénylebontó hatás lényegében a pektinsav-transz-eliminázok (PATE) jelenlétével kapcsolatos. Az enzim természetes növényi anyagokon kifejtett nagymértékű lebontó hatása nem várható, újszerű és meglepő. Az enzim előállítása céljából a Bacillus polymyxa-t szubmerz aerob körülmények között tenyésztjük. Előnyösen vizes táptalajokat alkalmazunk, amelyek szénforrásként keményítőt, nádcukrot, melaszt vagy glükózt, nitrogénforrásként szójabablisztet, kukoricalekvárt, élesztőkivonatot, peptont, nitrátokat vagy ammóniumsókat, továbbá szerves vagy szervetlen sókat, elsősorban kalciumkarbonátot tartalmaznak. Az enzimet a Bacillus polymyxa anaerob tenyésztésével is nagy hozammal állíthatjuk elő, az aerob tenyésztés azonban általában üzemileg könnyebben megvalósítható módszer. A fermentációt szakaszos vagy folyamatos üzemben, keverés és levegőztetés közben hajtjuk végre. A közeg pH-értékét előnyösen 5,2 és 7,8 között tartjuk. A fermentáció a fermentorok méreteitől függően általában 2—4 napot vesz igénybe. Ezután az enzimkoncentráció lényegében már nem fokozódik. Az enzimet a fermentlé nagy mennyiségben — kereken kb. 30 000 egység/ml koncentrációban — tartalmazza. Az enzimet vízzel elegyedő szerves oldószerekkel, pl. acetonnal vagy izopropanollal csapjuk ki a szűrt fermentléből, majd szárítjuk. A szilárd, nyerstermékként kapott enzim aktivitása 1500—3000 egység/mg. Tápanyagban különösen dús táptalajok felhasználása esetén az enzimhozam kb. 130 000 egység/ml-re növelhető. Ezekben az esetekben azonban a száraz enzimpor előállítása során nehézségek lépnek fel, ugyanis a közeg nagy mennyiségű nyákos anyagot tartalmaz, amelyek a steril szűrést, a kicsapást és a szárítást nagymértékben megnehezítik. További hátrányt jelent, hogy a fenti körülmények között higroszkópos porok képződnek. Az enzimet különösen nagy hozammal állíthatjuk elő a Bodensee vizéből elkülönített Bacillus polymyxa K 890/3 (ATCC 21551) törzs, továbbá az említett törzs variánsainak, mutánsainak és revertánsainak tenyésztésével. A K 890/3 törzs morfológiai és fiziológiai sajátságait az ismert ATCC 842 törzsével összehasonlítva az 1. táblázatban ismertetjük. 1. táblázat 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Jellemző Bacillus polymyxa Jellemző ATCC 21551 ATCC 842 Glükóz hasznosítása + G + G Szacharóz hasznosítása + G + G Glicerin hasznosítása + G + G Arabinóz hasznosítása + G + G Xilóz hasznosítása + G + G Mannit hasznosítása + G + G Laktóz hasznosítása + G + G Ramnóz hasznosítása + G + G Szorbit hasznosítása + G + G Pektin hasznosítása + G + G Spórák mérete 0,7 x 0,8," 0,6x1,0,« Kacsok mérete 2,5 x 5,0," 2,0 x 7,0M Keményítőlebontás + + Karbami dlebontás — — Fenilalanin-dezamináz — — Oxidáz — — Aerob növekedés + + Anaerob növekedés + G + G Antibiotikus aktivitás + + Pigmentképzés — — Tojássárga-reakció ± — Gram-festés + + Mozgékonyság + + Nyálkásodás + + Zselatinlebontás + + Citokróm-oxidáz — — Proteázaktivitás + + PATE + + Zsírlebontás + + H2 0 2 hasítás + + Foszfatáz + + Lizin-dekarboxiláz — — Megjegyzés: a szénforrás-hasznosítást szervetlen nitrogénforrás (NH4 +-só) jelenlétében mértük G = gázfejlődés + = pozitív (ill. fellép) — = negatív (ill. nem lép fel) + = bizonyos körülmények között pozitív A Bacillus polymyxa-ból származó enzimek lebontó hatásának mennyiségi és minőségi vizsgálatát a bélemésztés körülményeihez nagymértékben hasonló kísérleti körülmények között végezzük. Tekintettel arra, hogy a növényi táplálékok általában finoman elrágott formában jutnak a bélrendszerbe, az in vitro kísérletek során a friss és előfőzött növényi anyagokat homogenizátum formájában mérjük be. A bélrendszerben a tápanyagpép pH-ja az élettani szabályozó mechanizmus következtében közel semleges értékre áll be. Ezt a körülményt az in vitro kísérletekben úgy vesszük figyelembe, hogy a növényi anyagokat
