165202. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növénylebontó enzim előállítására

165202 erős hatású pufferoldatokkal elegyítjük, amelyek az elegy pH-ját kb. 7,0 értéken stabilizálják. A homogenizált növényi anyagokat igen csekély mennyiségű, Bacillus polymyxa-ból származó enzimmel több órán át inkubáljuk. Azt tapasztaltuk, hogy a növényi részecskék igen nagy mértékben lebomlanak. A sejtfalak feloldódási folyamatának mértékeként a növényi száraz maradékok súlyát adjuk meg a kontrollal összehasonlítva. Ebben az esetben 60%-ig terjedő súlycsökkenést észlelhetünk. Ugyanígy vizsgálhatjuk mennyiségileg a szövetrészecskék rugalmas sajátságainak csökkenését is. Összehasonlítás céljából a fenti körülmények között egyéb mikroorganizmusokból származó pektinázokat, cellulázokat és hemicellulázokat, továbbá ismert pektinolitikus enzimkészítményeket is megvizsgáltunk. Azt tapasztaltuk, hogy a Bacillus polymyxa-ból elkülönített enzim az öszszehasonlító anyagokénál lényegesen és meglepően nagyobb hatással rendelkezik. Az irodalomból ismert enzimelegyek elsősorban a sejtfalak középlemezére hatnak, ezzel szemben a Bacillus polymyxa-ból elkülönített enzimek hatására az egész sejtfal elfolyósodik. Ez a jelenség pl. mikroszkópos vizsgálattal észlelhető. A részecskék rugalmasságának különösen nagymértékű csökkenése is ezzel a folyamattal magyarázható. A sejtfalaknak az enzim hatására bekövetkező nagymértékű súlycsökkenése azzal magyarázható, hogy az enzim lebontó hatása nemcsak a jelentéktelen tömeget képviselő középlemezre, hanem az egész sejtfalanyagra kiterjed. A találmány szerint előállított enzimnek emésztést elősegítő készítménykénti alkalmazása szempontjából elsőrendű jelentősége van annak, hogy az enzim hatására a teljes sejtfal feloldódik, ugyanis így a bélrendszer természetes emésztő enzimei könnyebben jutnak érintkezésbe a növényi sejtek belsejébe zárt anyagokkal. A Bacillus polymyxa-ból kiinduló enzim-előállítás körülményeinek kidolgozása és az enzimtartalom ellenőrzése céljából elegendő a készítmények, ill. fermentlevek PATE-aktivitását meghatároznunk. A rutinvizsgálatot pektinsav-szubsztrátumon végezzük. Az eliminációs hasítási mechanizmus során a karboxilcsoporttal konjugált helyzetben kettős kötés alakul ki. A mérés során a kettős kötés kialakulásával kapcsolatos, 235 m.M-nál fellépő abszorpciófokozódást mérjük. Az enzimhatás optimális pH-értéke növényi sejtfalak lebontása esetén 6 és 8 között van. Az enzim stabilitása vizes oldatokban, 4,0—8,0 pH-tartományban igen jó. A pektinsav-transz-elimináz a bél-proteázok, pl. tripszin és kimotripszin hatásának nagymértékben ellenáll. PATE biokémiai vizsgálata Szubsztrátumként 0,1% pektinsavat és 0,001 m kalciumkloridot használunk 0,1 m pH = 8,5 értékű trisz/HCl pufferoldatban. A kísérletek során 10 mm-es kvarcküvettában 2 ml szubsztrátumot 0,1 ml megfelelő hígítású enzimoldattal elegyítünk, és az elegyet 2 percig 25 °C-on inkubáljuk. A regisztrálást kiíró berendezéssel öszszekötött spektrofotométerben végezzük, 235 m/« hullámhosszon. 1 egységnek az az enzimmeny-5 nyiség felel meg, amely a reakció körülményei között 10 perc alatt 0,1 értékű extinkciónövekedést idéz elő. A vizsgált szűrt fermentlevek (a felhasznált baktériumtörzstől és a tenyésztés körülményeitől függően) milliliterenként 1—130xl08 j0 egység PATE-t tartalmaznak. A lebontó hatás biokémiai vizsgálata 15 Szubsztrátumként karalábét (vagy egyéb növényi anyagot) használunk, amelyet 0,25 mólos imidazol-pufferral (pH = 7,0) homogenizálunk. A sűrűn folyó pép pH-értékét híg nátriumhidroxid-oldattal 7,0-ra állítjuk be. A kísérletek cél-20 jára 30 ml szubsztrátumot 1 ml enzimoldattal elegyítünk, és az egyes mintákat sorozathígításban, külön részletekben 7 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az oldhatatlan sejtfalmaradékokat kb. 2000 g gyorsuláson centrifugáljuk, és 2x50 ml 25 vízzel, 1x50 ml alkohollal és 2x50 ml acetonnal mossuk. A mosott anyagot levegőn szárítjuk, majd a légszáraz anyagot 4 órán át 120 °C-on tartjuk, és ezután lemérjük a száraz maradék súlyát. Az egyes kísérletsorozatokban 2—3 kont-39 rollértéket határozunk meg. Az enzimhatás következtében fellépő súlycsökkenést %-osan a kontrolleredményekre vonatkoztattuk. A 2. táblázatban különféle ismert pektináz-, hemicelluláz- és cellulázkészítmények akti vi tá-35 sát hasonlítjuk össze a különböző Bacillus polymyxa-törzsek felhasználásával előállított nyers, por alakú enzimek hatásával. Vizsgálati növényként karalábét használtunk. Az enzimkoncentrációt minden esetben 3 mg/30 ml homogenizá-4Q tum, ill. 0,3 mg/30 ml homogenizátumértékre állítottuk be. A mérés hibahatára a kontrollokra viszonyítva + 3%. 45 50 55 60 65 2. táblázat Az enzimet előállító törzs Növényi anyag súlycsökkenése, % 3 mg 0,3 mg enzim enzim Aspergillus niger 7 4 Aspergillus oryzae — — Penicillium chrysogenum 6 3 Penicillium frequentans 5 4 Sclerotinia fructigena 6 4 Bacillus mesentericus -— — Kereskedelemben kapható különféle pektináz-, celluláz- és hemicelluláz-készítmények (a törzset nem ismerjük) -<8 <5 Bacillus polymyxa K 890/3 58 30 Bacillus polymyxa K 890/1 53 26 Bacillus polymyxa K 890/2 41 15 Bacillus polymyxa K 890/4 24 5