165175. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tiszta, krisztályos penicillin-aciláz előállítására
16&175 8 alakjában kapjuk, akkor ezt az oldatot a kristályosítási művelet előtt célszerűen yalamely ismert eljárással betöményítjük; ez például membránszűrés útján, vagy pedig oly módon történhet, hogy 70%-os telítettségig ammóniumszulfátot adunk az oldathoz és az így kicsapott enzimet kisebb térfogatban ismét oldjuk. A kristályosítás a fehérjekoncentráciőtól függően 45— 55%-ig telített ammóniumszulfát-oldatből történhet, előnyösen 6,0 és 7,0 közötti pH-értéken; szobahőmérsékleten a kristályosítás néhány nap alatt megy végbe. A gyorsan képződött kristályok mikroszkóp alatt szilánkos tű alakot mutatnak; lassú kristályosítás esetén igen szabályos alakú táblás kristályokat kapunk, amint ezt az 1. ábrán 200-szoros nagyításban láthatjuk. Ha az így kristályosított enzim oldatát tárcsa-elektroforézissel vizsgáljuk (7% géllel, 8,9 pH-értéknél), akkor egyetlen éles sávot kapunk, amint ezt a 2. ábra szemlélteti. A tiszta, kristályos penicillin-aciláz a következő jellemző tulajdonságokat mutatja: Specifikusság: hasítja a benzilpenicillint, N-fenacetil-L-aszparagint, 6^nitro-3-(N-fenaeetil)-amino-benzoesavat és más fenilecetsav-amidokat. Molekulasúly: 71000 ± 2000 (ülepedési egyensúly alapján, v = 0,665 ml/g parciális fajlagos térfogattal); 70000 + 5000 (vékonyrétegű gélszűréssel). Ülepedési együttható: S°2o)w =* 2,56 + 0,035 7.4 oH-nál. Ibolyántúli színkép (3. ábra); 7,0 pH-értékű foszfát-pufferoldatban: 3A. ábra; 0,1 n nátriumhidroxid-oldatban: 3B. ábra. CD-spektrum: 4—10 pH-nál: 4. ábra; 250 nm; 0,085 mg/ml, d= 0,1 cm; 250 nm: 8,85 m<?/ml, d == 1 cm. Izoelektromös pont: 6,8 + 0,2 (az elektrofókuszálás módszerével meghatározva). A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről a következő példák szemléltetik; megjegyzendő azonban, hogy a találmány köre nincsen ezekre a példákra korlátozva. 1. példa. a) A találmány szerinti eliárás lefolytatásához szükséges nyers kivonatot Escherichia coli sejtekből kapjuk, oly módón, hogy a"z E. coli ATCC 11105 mikroorganizmust az 1111 778 sz. Német Szövetségi Köztársáság-beli szabadalmi leírásban ismertetett módon tenyésztjük, a kultúrát centrifugálással töményítjük, majd a sejteket úgy tárjuk fel, ho*v a centrifugált sejttömeghez 3% Bietílizobutilketont adunk és a pH«érték 7,5-re történő beállítása után a szuszpensáót több óra hosszat keverjük. b) 90 liter így kapott nvers kivonatot 5.0 pH-értékre állítunk és centrifugáljuk az elegyet 80 liter tiszta oldatot kapunk, amely 62 0ÓÖ egység enzimet tartalmaz, 0,25 egység/mg fajlagos aktivitással. Ezt az oldatot Lewatjt M 600 és S 100 ioncserélőt tartalmazó kevertágyas ioncserélő készítmény bekeverése útján 1,5 mS értékig sót* &. lanítjuk. Az ioncserélőt ezután szűréssel eltávolítjuk, a szürlet pH-értékét ismét 5,0-ra áffiíjuk, majd 350 g bentonitot (SF típus, a Serva cég, Heidelberg, készítménye) adunk hozzá, 30 percig keverjük, majd a bentonitot átáramoltató cent^ 1« rifuga segítségével eltávolítjuk. Az így kicentrifugált bentonitot 5 liter 0,5 mólos, 8,0 pH-értékű nátriumfoszfát-pufferoldattal eluáljuk és az elu~ átumot szűréssel elkülönítjük. Így 5,2 liter eluátumot kapunk, amely 40 000 E (egység) enzimet 15 (65%) tartalmaz, 1,45 E/mg fajlagos aktivitással. c) A fenti módon kapott eluátum 9000 E enzintartalomnak megfelelő részét gélszűréssel sótalanítjuk, pH-értékét 5,0-ra állítjuk, SE-Sepha-20 dex ioncserélőt tartalmazó, 5 X 10.0 cm méretű, 0,05 mólos nátriumacetát-oldattal egyensúlyba hozott ioncserélő oszlopra visszük, majd az eluálást lineáris gradienssel, 4—4 liter 0,07 és 0,25 mólos, 5,0 pH-értékű nátriumacetát-oldattal vé~ 25 gezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük; ily módon 8100 E enzimet (az elméleti hozam 90%-a) tartalmazó oldatot kapunk. Ezt az oldatot 70%-ig telített ammóniumszulfáttal töményítjük; így 5,8 E/mg fajlagos aktivitást érünk el. 30 d) A fenti módon töményített enzimoldathoz 50%-os telítettségig telített ammóniumszulfát-oldatot adunk; az ennek során fellépő enyhe zavarosodást centrifugálással eltávolítjuk. Az olda* tot azután 4 °C hőmérsékleten tartjuk és így né-35 hány nap alatt az enzim kikristályosodik. 2. példa Az 1. példa a) bekezdése szerint kapott 60 liter 40 feltárt nyers kivonatot 5,0 pH-értékre állítjuk és centrifugáljuk. A tiszta szupernatáns oldat 92 000 E enzimet tartalmaz, fajlagos aktivitása 0.45 E/mg. Az oldatot kevertágyas ioncserélő hozzáadása útján 1,0 mS értékig sótalanítjuk. Az így 45 kapott oldathoz 5,0 pH-értéknél először 150 g bentonitot adunk, majd ezt centrifugálással eltávolítjuk. Ezután további 200 g bentonitot adunk hozzá, ezt a bentonitot centrifugálással elkülönítjük és 5 liter 1 mólos, 8>,0 pH-értéVű 50 nátriumacetát-oldattal eluáljuk. A kaoott olda? 51 000 E enzimet (az elméleti hozam 53%-a) tartalmaz, amelynek fajlagos aktivitása 1,8 E/mg. Az eluátumot gélszűréssel sótalanítjuk, majd az így kapott oldatból az 1. példa c) bekezdésé-55 ben leírt módon, SE-Sephadex ioncserélőn tör-? ténő kromatografálással kapjuk a tiszta enzim oldatát. Ezt az oldatot az 1. példa d) bekezdésében leírt módon töményítjük és a penicillin-acilázt telített ammőniumszulfát-oldatnak a leírt 60 módon történő hozzáadása útján kristályosítjuk. 3. példa 2900 liter térfogatú E. coli kultúrából az 1. példa. WS a) bekezdésében leírt tnődon kapott leltárt nyers
