165175. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tiszta, krisztályos penicillin-aciláz előállítására

10STF5 9 kivonatot 5,0 pH-értékre állítunk és centrifugáljuk. A kapott 256 liter tiszta szupernatáns oldat 150 000 E enzimet tartalmaz, amelynek fajlagos aktivitása 0,32 E/mg. Ezt az oldatot vízzel 920 literre hígítjuk és így fajlagos vezetőképességét 2 mS-re csökkentjük. 1 kg bentonitot adunk hozzá, majd ezt egy órai keverés után céntrifugálással elkülönítjük. 8,0 pH-értékű, 0,5 mólos nátriumacetát-oldattal eluálunk és így 6,9 liter eluátumot kapunk, 62 000 E enzimtartalommal, amelynek fajlagos aktivitása 1,2 E/mg. A bentonit 0,5 mólos nátriumszulfát-oldattal történő második eluálása útján további 9800 E enzimet kapunk; összhozam: 47%. Az első eluátum 47 000 E enzimtartalomnak megfelelő részét gélszűréssel sótalanítjuk, 5,0 pH-értékre állítjuk, majd 400 ml nedves, előzőleg 0,05 mól-os, 5,0 pH-értékű nátriumacetát-oldattal egyensúlyba hozott SE-Sephadex ioncserélő bekeverése útján az enzimtartalmat mennyiségileg adszorbeáltatjuk. A SE-Sephadex-gélt szűréssel elkülönítjük és egy olyan 5 cm átmérőjű oszlopba töltjük, amely már tartalmaz 1600 ml friss SE-Sephadex ioncserélőt 5,0 pH-értékű, 0,05 mólos nátriumacetát-oldatban. Az eluálást lineáris gradienssel, 4—4 liter 0,007 és 0,25 mólos 5,0 pH-értékű nátriumacetát-oldatban végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük. Az így kapott oldat 36 000 E tiszta enzimet tartalmaz, amelynek fajlagos aktivitása 5,3 E/mg. Az így kapott tiszta enzimoldatot betöményítjük és óvatosan, enyhe zavarosodás fellépéséig, szilárd ammóniumszulfátot adunk hozzá. Az elegyet 4°C hőmérsékleten állni hagyjuk; az enzim néhány nap alatt kikristályosodik. 4. példa a) A találmány szerinti eljárás lefolytatásához szükséges nyers enzimki vonatot E. coli sejtekből nyerjük, oly módon, hogy E. coli ATCG 21 728 törzs kultúráját centrifugáljuk, az így töményített sejttömegben a sejteket az ismert mechanikai eljárással, adott esetben 3% metilizobutilketon hozzáadásával, feltárjuk. b) 610 liter így kapott nyers kivonatot, amely 1,3 .106

E enzimet tartalmaz, iontalanított vízzel 2100 liter térfogatra hígítunk, pH-értékét kénsav hozzáadása útján 5,0-ra állítjuk, majd centrifugáljuk. A kapott tiszta szupernatáns oldatban 1,42.106

E enzimet találunk, 0,42 E/mg fajlagos aktivitással. Az oldat pH-értékét ismét beállítjuk 5,0-ra, majd 13,8 kg bentonitot (B II típus, az Erbslöh cég készítménye) keverünk be az oldatba, azután 30 perc múlva egy átáramoltató centrifuga segítségével a bentonitot elkülönítjük. Az így elkülönített bentonitot 90 liter 0,5 mólos, 8,0 pH-értékű nátriumacetát-oldattal eluáljuk, majd leszűrjük az eluátumot. 92.5 liter oldatot kapunk, amely 1,12.106 E enzimet (az elméleti hozam 88%-a) tartalmaz, 1,64 E/mg fajlagos aktivitással. c) A b) bekezdés szerinti mödon kapott 1 liter eluátumot 0,001 mólos kálíumfoszfát-pufferoldattal (pH = 7,0) szemben diaíi'záljuk; á kapott oldat 8250 E 1,8 E/mg aktivitású enzimet tartalmaz. Ezt az enzimoldatot egy 10X15 cm méretű, DEAE-Sephadex A—50 ioncserélőt ugyanilyen 5 puff eroldatban tartalmazó oszlopra visszük. Az eluálást lineáris gradienssel végezzük, 2—2 liter 0,01 és 0,1 mólos, 7,0 pH-értékű pufferoldattal. 25 ml térfogatú frakciókat fogunk fel; a penicillin-aciláz enzimet a 110—170. frakcióban kap-10 juk. Az így kapott enzimoldat 6760 E enzimet (az elméleti hozam 82%-a) tartalmaz, 6 E/mg fajlagos aktivitással. d) A c) bekezdésben leírt módon kapott oldatból az enzimet 472 g/liter szilárd ammóniumszul-15 fát hozzáadása útján lecsapjuk, a csapadékot céntrifugálással elkülönítjük és vízben oldjuk. Az így kapott oldat 4700 E enzimtartalömnak megfelelő részéhez ammóniumszulfátot adunk 46%-os telítettségig, majd az oldatot tisztára 20 centrifugáljuk és szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az enzim 1 hét alatt kikristályosodik. A kapott kristályokat céntrifugálással elkülönítjük, 0,01 mólos foszfát-pufferoldatban oldjuk és ugyanezzel a pufferrel szemben dializáljuk.; 25 Az így kapott dializált oldat 3300 E enzimet (az; elméleti hozam 70%-a) tartalmaz, 12,45 É/mg fajlagos aktivitással. 5. példa 3« 60 liter feltárt nyers extraktumot, amelyet a 4. példa a) bekezdésében leírt módon kaptunk, 5,0 pH-értékre állítunk és centrifugáljuk. A kapott tiszta szupernatáns oldat 155 000 E enzimet 35 tartalmaz, 0,3 E/mg fajlagos aktivitással. Ezt az oldatot kevertágyas ioncserélő hozzáadása útján 1,0 mS fajlagos vezetőképesség-értékig sótalanítjuk. Az oldathoz ezután 5,0 pH-értéknél 200 g bentonitot (SF típus, a Serva cég gyártmánya) 40 adunk, ezt a bentonitot azután céntrifugálással elkülönítjük és kiselejtezzük. Ezután további 800 g ugyanilyen minőségű bentonitot adunk hozzá, ezt a bentonitot céntrifugálással elkülönítjük, majd 20 liter 0,5 mólos, 8.0 pH-értékű nátrium-45 acetát-oldattal eluáljuk. Eluátumként oly enzimoldatot kapunk, amely 110 000 E enzimet tartalmaz, 1,5 E/mg fajlagos aktivitással. Ezt az enzimoldatot 0,5 mólos, 5,0 pH_értékű nátriumacetát-pufferoldattal szemben dializál-50 juk, majd a dializáit oldatot egy 11 X 95 cm méretű, SE-Sephadex C—50 ioncserélőt 0,05 mólos, 5,0 pH-értékű nátriumacetát-pufferoldatban tartalmazó oszlopra visszük. Az oszlopot lineáris gradienssel eluáljuk, 15—15 liter 0,07 és 0,25 55 mólos, 5,0 pH-értékű nátriumacetát-oldattal. A penicillin-acilázt az eluátumnak a 24. litertől a 27. literig terjedő részében karajuk; a kapott oldat 88 000 E enzimet (az elméleti hozam 80%-a) tartalmaz, 4,2 E/mg fajlagos aktivitással. 60 Az így kapott oldat 29 000 E enzimtartalomnak megfelelő részét 0,01 mólos, 7,0 pH-értékű káliumfoszfát-pufferoldattal szemben dializáljuk, majd egy 11 X 25 cm méretű, DEAE-Sephadex A—50 doncserélőt 0,01 mólos, 7,0 pH-értékű <>5 Icáliúmfoszfát-pufferöldatban tartalmazó oszlop-