165175. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tiszta, krisztályos penicillin-aciláz előállítására

1651TS fajlagos vezetőképességnél és 5,0 pH-értéknél dolgozunk. Az enzimoldatnak a kívánt vezetőképesség-értékre való beállítása hígítással, kevertágyas ioncserélők segítségével való iontalanítássál vagy más szokásos iontalanítási eljárással történhet. A legjobb hozamokat akkor érjük el és az eluálás során akkor biztosíthatjuk a hatóanyag legelőnyösebb feldúsítását, ha az adszorbeálta táshoz csak éppen annyi bentonitot használunk, amennyi az enzim 100%pos adszorpciójára szükséges, ezt a szupernatáns folyadék mintájával végzett aktivitásmérés útján ellenőriz.hetjük. Az előnyös eljárási körülmények között 1 g oldott fehérjére körülbelül 2,0—5,0 g betonit szükséges. Még jobb tisztítási fokot érünk el, ha frakcionált adszorbeáltatást alkalmazunk oly módon, hogy először csupán a szükséges bentonit összmennyiségének körülbelül 1/5 részét adjuk hozzá, amikor is csaknem kizárólag az inaktív idegen fehérjék adszorbeálódnak. Az így hozzáadott bentonit elkülönítése után adjuk az oldathoz a bentonit fennmaradt részét és ezzel adszorbeáltatjuk a penicillin-acilázt. Az adszorbeált penicillin-aciláz eluálására valamely só, például foszfát, szulfát, acetát vagy hasonlók 0,1—1,0 mólos vizes oldatát alkalmazzuk, 6,0—9,0 pH-értékeknél. Előnyösen nátrium- vagy káliumacetát 0,1—1,0 mólos, 8,5 pH-értékű oldatát alkalmazzuk, minthogy ilyen oldat alkalmazása esetén — két vagy három vegyértékű anionokkal képezett sókhoz viszonyítva — szelektívebben eluálható a penicillin-aciláz. A bentoniton történő adszorbeáltatás és az enzim éluálása útján összesen körülbelül 4—6-szorosan dúsíthatjuk fel az enzimet, 70—90%ros hozam mellett. Az ilyen tisztítási művelet különleges előnye, hogy ez a módszer ipari méretekben igen egyszerű módon kivitelezhető, az enzimet tartalmazó oldatot a kiindulási nyers extraktum térfogatára számítva körülbelül 1/10-re csökkentett térfogatban kapjuk, olyan mértékben megnövelt koncentrációban, amely az enzim további feldolgozását lényegesen megkönnyíti. A kapott penicillin-aciláznak a tiszta enzimffehérjéig történő további tisztítása a találmány szerinti eljárásban kromatografálással és ezt követő kristályosítással történik. A kromatografálást erre alkalmas makropórusos ioncserélökkel folytatjuk le; fennek során vagy egy anioncserélővel, vagy pedig egy kationcserélővel kezeljük az oldatot és így egy olyan részlegesen tisztított enzimoldatot kapunk, amelyből azután a tiszta enzimet valamely lecsapó só hozzáadása útján kristályosíthatjuk ki. Eljárhatunk azonban oly módon is, hogy a kiindulási oldatot két lépésben, egy kationcserélővel és egy anioncserélővel kezeljük (tetszetőleges sorrendben), és így tiszta homogén enzimoldatot kapunk, amelyből ugyancsak kristályosítás útján nyerhetjük ki a tiszta enzimet. A fenti eljárásban anioncserélőként elsősorban bázisos csoportokkal szubsztituált cellulózszármazékok, mint áminoetil-cellülőz, diétilaminoetil-cellulóz (DEAE-cellulóz), trietilaminoetil-cellulóz (TEAE-cellulóz), valamint megfelelő hálós kötésű dextránok, például a DEAE-Sephadex vagy QAETiSephadex kereskedelmi néven ismert készítmények alkalmazhatók. Az ilyen anioncserélőkkel a tisztítási műveletet 6,5 és 9,0 5 közötti pH-értéken végezhetjük. Az eljárást előnyösen ioncserélő oszlopon folytatjuk le. Az enzimet híg sóoldatból adszorbeáltatjuk és az eluáló pufferoldat pH-értékének csökkentése vagy :.:.. sókoncentrációjának növelése útján eluáljuk. Az 10 eluálás során a penicillin-aciláz aktivitású terméket rendszerint az oszlopról való ejuálás első fehérje-csúcsértéknek megfelelő frakcióiban kapjuk. Az eluálást előnyösen 7,0 pH-értékű káliumfoszfát 0,01 móltól 0,1 mólig növekvő kon-15 centrációjú oldataival végezzük. E tisztítási lépésben a termelési hányad 80—90%. ... Kationcserélőként különösen a savas csoportokkal szubsztituált cellulózszármazékok, mint szulfoetil-cellulőz!, foszfo-cellulőz, karboximetil-20 -cellulóz, továbbá hálós kötésű dextránok, például a SE^Sephadex, SP-Sephadex, CM-Sepha^dex kereskedelmi néven ismert készítmények, valamint akrilamid-gélek, például a CM-Bio-Gel kereskedelmi néven; ismert készítmény, a Bio-25 chemistry 8, 4074 (19691) közleményben leírt módon előállított karboxilcsoport-tartalmú poliakrilamid-gélek és makropórusos ioncserélő gyanták, például a Lewatit SP—100, SP—120 és CNP ,. kereskedelmi néven ismert készítmények alkal-30 mázhatok. A fentebb kereskedelmi néven említett ióncserélő készítmények közül a" Sephadex néven ismert készítmények a Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, a Bio-Gel készítmények a Bio-35 -Rad Laboratories cég, a Lewatit készítmények pedig a Farbenfabriken Bayer AG. cég védjegyzett készítményei. • > A penicillin-aciláznak a kationcserélőn való adszorbeál tatása 0,01—0,1 mólos sóoldatból, 3,5 40 és 6,0 közötti, előnyösen 5,0 pH-értékű közegben történhet, mégpedig oly módon, hogy vagy az ioncserélőt adjuk hozzá az enzim oldatához, vagy pedig az enzimoldatot vezetjük keresztül az ioncserélővel töltött oszlopon. Az eluálást magasabb 45 pH-értéknél, 6,0 és 8,5 között, vagy előnyösen azonos pH-értéknél, dé lineáris gradiens szerint vagy fokozatosan megnövelt sókoncentrációjű oldattal végezzük. A találmány szerinti eljárás előnyös kiviteli módja esetében az eluálást 5,0 50 pH-értéknél, lineáris gradiens szerint növekvő 0,05—0,5; mólos koncentrációjú nátrium- vagy káliumacetát-oldattal végezzük. A tiszta penicillin-aciláz éluálása ilyen körülmények között éleS zónában, körülbelül 0,2 mólnátriumacetát-kön-55 centrációnál, 80— 90%-os termelési hányaddal történik. A csupán anioncserélő alkalmazásával, vagy pedig anioncserélő és kationcserélő kombinált alkalmazásával kapott/nagymértékben dúsított 80 penicillin-aciláz-oldatból azután az enzimet valamely erre alkalniás, kicsapó hatású só, előriyÖ^sen ammóniumszulfát hozzáadásával kristályosítjuk ki. Az említett .sö tömény öldát alakjában a.< vagy szilárd állapotban adható: a dúsított enzim-69 oldathoz. Ha az enzimet erősen hígított oldat