165175. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tiszta, krisztályos penicillin-aciláz előállítására
16&1?5 másfajta enzimek által okozott elbontása (különösen a penicillin-/í-laktamáz enzim oüoz ilyen káros hatásokat), aminek következtében a kívánt 6-amino-penicillánsav hozama számottevően csökken. További hátrány, hogy az ilyen módon kapott ö^amino-penicillánsav terméket különféle kísérő fehérjék szennyezik, amelyek az így előállított 6-amino-penicillánsavból gyártott, szintetikus penicillineknek az embergyógyászati alkalmazása során allergiás reakciókat okozhatnak. Az ilyen kísérő szennyezések viszont csupán körülményes és veszteséges tisztítási műveletekkel távolíthatók el a 6-amino-penicillánsav mellől. Teljes sejteknek vagy nyers, sejtmentes enzimeknek az alkalmazása esetén mutatkozó ilyenfajta hátrányok kiküszöbölése csupán tiszta penicillin-aciláz készítmények alkalmazása esetén érhető el. Eddig azonban ez ipari méretekben nem volt biztosítható, mert nem állott rendelkezésre egyszerű, iparilag megvalósítható eljárás az enzim tiszta állapotban történő előállítására. Egyes szerzők már ismertettek módszereket a penicillin-aciláz kis mennyiségekben történő részleges tisztítására (vö. Borkar P. S. és munkatársai, Hindustan Antbiotics Bull. 4, 152, 1961, Szentirmai A. Acta Microbiologica Acad, Sei. Hung. 12, 395, 1966; Self D. A. és munkatársai, Biotechnology and Bioengeneering 11, 337, 1969). Ezekben az eljárásokban azonban többszörös lecsapási, adszorbeáltatásí és kromatografálási műveleteket allkalmaznak és csupán csekély hozamokat érnek el. A 6 908 045 sz. dél-afrikai szabadalmi bejelentés (Chem. Abstr. 74, 86 386 t) szerint az enzim részleges tisztítását acetonnal szárított E. coli sejtekből kapott extraktum Sephadex molekulaszitán végzett szűrésével valósítják meg. Nagyobb méretekben történő tisztítást ír le az 1 907 365 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi bejelentés nyilvánosságra hozott leírása, amelynek során tanninnal történő lecsapást és különféle ioncserélőkkel történő tisztítást alkalmaznak. Egy elektroforézises vizsgálattal homogénnek mutatkozó acüázkészítményt állítottak elő laboratóriumi méretekben Bondareva és munkatársai (Biohimija. 34, 76, 1969), ámmóniumszulfáttal történő lecsapás, karboximetil-cellulózqn, majd DEAE-cellulózon való kromatografálás útján; így 27%-o<s hozammal kaptak a tisztának tekintett készítményt. A penicillin-aciláz kristályos alakban történő előállítását az eddigi irodalom nem ismerteti. Az irodalomban eddig szereplő, ismert eliárások vagy csupán részlegesen tisztított enzinkészítmény előállítását teszik lehetővé, var?y pedig igen bonyolult és veszteséges műveletek alkalmazásával járnak. így tehát továbbra is fennáll á szük«é<tlet egy egyszerű, iparilag jól alkalmazható elírásnak a kidolgozására, tiszta penicillin-aciláz enzim előállítására. Kívánatos továbbá az enzimkészítménv kristályos alakban történő előállítása, minthosv ezáltal egyrészt könnyebben teljesíthetők a tisztasági követelmények, másrészt kristályszuszpenzió alakjában az enzim stabilan szállítható és tárolható. A találmány tárgyát olyan eljárás képezi, amellyel E. coli mikroorganizmusból egyszerű 5 módon nyerhetünk tiszta penicillin-aciláz enzimet kikristályosított alakban. Bentoniton történő adszorpció és eluálás útján a készítmény térfogatát olyan nagy mértékben csökkenthetjük, hogy ezáltal lehetővé válik a találmány szerinti 10 eljárás ipari méretekben történő megvalósítása. A találmány szerint előállított penicillin-aciláz enzim aktivitását egy újszerű kolorimetriás vizsgálati módszerrel határozzuk meg, amely az enzim széles körű specifikusságát hasznosítja. 15 Vizsgálati szubsztrátumként 6-nitro-3-(N-fenilacetil)-amino-benzoesav (NIPAB) kerül felhasználásra; a mérést 0,002 mólos oldatban, 7,5 pH-értéknél, 25 °C hőmérsékleten, 405 nm hullámhosszon végezzük. A reakció során keletkező 20 6-nitro-3-amino-benzoesav moláris extinkciós együtthatója 90901. mól-1 . cm-1 . Egy enzimegység (E) percenként 1 mikromól szubsztrátumot hidrolizál. A benzilpenicillin hidrolízise ugyanilyen körülmények között kb. 1,5-ször gyorsab-25 ban megy végbe. A megadott fajlagosaktivitásértékek a biuretmódszerrel meghatározott fehérjetartalomra vannak vonatkoztatva. A találmány szerinti eljárás során kiindulási anyagként az E. coli sejtekből kapott nyers ext-30 raktumot használjuk fel. Ezt például oly módon állítjuk elő, hogy az 1111 778 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírás szerint előállított E. coli sejtkultúrát vagy előnyösen az ATCC 21 728 E. coli törzs kultúráját 7—8 pH-ér-35 téken 3% metilizobutilketonnal kezeljük vagy mechanikai úton feltárjuk, és így a sejtekben jelenlevő penicillin-aciláz enzim 70—90%-át oldatba visszük. Az így kapott nyers kivonatot a találmány ér-40 telmében a szétroncsolt sejtmaradványok lecsapásának megkönnyítése és egyidejűleg a penicillin-aciláz tisztítása céljából valamely ásványi sav, például sósav, salétromsav, kénsav, foszforsav, vagy valamely más erős sav, például ecet-45 sav hozzáadásával 3,5 és 5,5 közötti, előnyösen 5,0 körüli pH-értékre hozzuk, így az inaktív fehérjéket és egyéb kísérőanyagokat is lecsapjuk, majd a lecsapott anyagokat a szokásos módon .. centrifugálás vagy szűrés útján elkülönítjük és 55 kiselejtezzük. A kapott tiszta szupernatáns oldatból a penicillin-aciláz enzimet valamely alumíniumszilikát-ásvány, előnyösen valamely montmorillonit típusú adszorbens, célszerűen bentonit alkalma-55 zásával adszorptív úton megkötjük, majd az enzimet adszorbeáló ásványi anyagot a szokásos módon, szűréssel vagy centrifugálással elkülönítjük és az így kapott szilárd maradékról a penicillin-aciláz enzimet valamely erre alkalmas 60 sóoldattal eluáljuk. .' : . ... A penicillin-aciláznak az ásványi adszorbensen történő adszorbeáltatása az oldat 0—5 mS fajlagos vezetőképessége mellett, 3,5 és 8,0 közötti: pH-értéknél történhet. A találmány szerinti el-65 járás előnyös kiviteli módja esetében 1—4 mS
