165094. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tio-citidin- és ditio-uridin-származékok előállítására
7 165094 8 tóanyagokkal és/vagy aromaanyagokkal elegyíthetjük. A hatóanyagokat előnyösen 0,1—100 mg hatóanyagot tartalmazó dózisegységek formájában adjuk be. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A „foszfátelemzés" kifejezésen a nukleotidrfbszfát arányt értjük, ezt az arányt a Can. J. Biochem. Physiol. 41. kötet, 469. oldalán (1963) közöltek szerint határoztuk meg. Az S20 , w értékeket analitikai ultracentrifugával, ülepedési sebességelemzéssel határoztuk meg. Az egyes hullámhosszokon mért abszorpcióértékek arányát Anm /A nm jelzéssel tüntettük fel. 1. példa a) 1 mmól bisz-trietilammónium-2,4-ditio-uridin-5'-foszfát és 10 ml dimetilformamid elegyéhez 2 mmól karbonü-diimidazolt adunk, és az elegyet 20 C° és 40 C° közötti hőmérsékleten tartjuk. 20 perc elteltével a képződött imidazolidáthoz 5 mmól trisz(tri-n-butil-ammónium)-foszfát 5 ml dimetilszulfoxiddal készített oldatát adjuk, és az elegyet éjszakán át állni hagyjuk. Az oldószer egy részét csökkentett nyomáson lepároljuk, és a maradékot 800 ml vízzel elegyítjük. A vizes oldatot 50X2,5 cm méretű dietilamino-etil-cellulóz-oszlopra visszük fsl, és 0 és 0,5 mól közötti, lineárisan fokozódó mennyiségű trietilammónium-hidrogénkarbonátot tartalmazó oldattal eluáljuk. A 2,4-ditio-uridin-5'-difoszfátot tartalmazó frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson, 15 C°-on szárazra pároljuk. A maradékot kevés metanolban felvesszük, az oldathoz 2 ekvivalens nátriumperklorát kevés acetonnal készített oldatát adjuk, és a terméket aceton hozzáadásával kicsapjuk. A terméket centrifugálással elkülönítjük, acetonnal többször mossuk, és 15 Hgmm nyomáson szárítjuk. Amorf 2,4-ditio-uridin-5'-diszfoszfát-dinátriumsót kapunk; hozam: 73%. UV-spektrum (vízben, pH = 5,5): Xmax . 280 nm és 340 na Foszfátelemzés: 1:2,2. Ha a fenti eljárásban bisz-trietilammónium-2 -tiocitidin-5'-foszfátból indulunk ki, 2-tio-citidin-5'-difoszfát-dinátriumsót kapunk; hozam: 86%. UV-spektrum (vízben, pH = 7,0):Xmax . = 247 nm, inflexió 272 nm-nél, A247/A272 = 1,23. Foszfátelemzés: 1:1,90. Hasonló módon állíthatjuk elő tetrakisz-(tri-n-butil-ammónium)-pirofoszfát felhasználásával a 2,4-ditio-uridin-5'-trifoszfát-trinátriumsót. Hozam: 47%; UV-spektrum (vízben, pH = 5,5): Ama x. 280 és 340 nm, Ajgo/A^o = 1,85; foszfátelemzés: 1:2,90. Hasonlóan állíthatjuk elő a 2-tio-citidin-5'-trifoszfáttrinátriumsót is. Hozam: 58%; UV-spektrum (vízben, pH = 7,0): Xmax. 247 nm, váll 272 nm-nél, A247/ /A272 = 1,30; foszfátelemzés: 1:2,95. A fenti példa szerint előállított vegyületeknél n + m= 2 (n= 0, m = 2). b) 0,4 mmól trisz-(Mdroximetü)-aminometán-hidroklorid puffert, 0,008 mmól magnéziumkloridot, 0,04 mmól 2,4-ditio-uridin-5'-difoszfát-dinátriumsót, 0,04 mmól ditio-treitet és 10 enzim-egység polinukleotid-foszforilázt (fajlagos enzimaktivitás 37 C°-on: 0,165 mmól UDP+óra«mg fehérje) tartalmazó 4 ml vizes elegyet (pH = 8,3) 4 órán át 37 C°-on inkubálunk. A fehérjét ezután többszöri kloroform-izoamilalkoholos (25:2 térfogatrész) extrakcióval eltávolítjuk. A vizes fázist 15 C°on kb. 1,5 ml térfogatra bepároljuk, és dializáló edényben 3 C°-on 48 órán át 0,01 mól trisz-(hidíoximetil—aminometán- hidroklo-5 ridot tartalmazó oldattal szemben (pH = 7,0) dializáljuk. A pufferoldatot négyszer cseréljük. Poli-2,4-ditio-uridin-5'-foszfátot kapunk. Hozam: 97%; S20 )W érték: 12 S; UV spektrum (vízben, pH= 7): Xmax 270 nm (ep = 3500); A 280 /A34o= 5,4; pK-érték: 9,2 10 (spektrofotometriás titrálással mérve). A termék 0,05 mólos nátrium-kakodilát-oldatban, pH = 7,0 értéken felvett ultraibolya spektrumában Tm = 81 C'Siál helix-spirál átalakulás lép fel. * Hasonlóan állíthatjuk elő a 2-tio-citidin-5'-difosz-15 fát-dinátriumsóból a poli-2-tio-citidin-5'-foszfátot. Hozam: 98%; S20 )W érték: 5 S; UV-spektrum (vízben, pH = 7,0): Xmax .' 244 nm, váll 270 nm-nél; A 244 / /A270 = 1,25. c) 0,003 mmól adenozin-trifoszfátot, 0,003 mmól 20 2,4-ditio-uridin-5'-trifoszfát-trinátriumsót,0,003 mmól ditio-trietet, 0,075 mmól magnéziumkloridot, 0,6 A2 60-egység (260 nm hullámhosszon 0,6-os ababszorpciót kiváltó mennyiségű (kb. 0,001 mmól) poli-dezoxi-ribo-adeninil-timidint és 360 enzim-25 egység RNS-polimerázt (a „Procedures in Nucleix Acid Research", G.L. Cantoni és D.R. Davies, kiadó: Harper and Row, New York és London, 1966. I. kötet 323. oldalán ismertetett termék) tartalmazó 2,5 ml elegyet 6 órán át 37 C°-on inkubálunk, majd az 30 elegyet 0,7 ml 4%-os nátrium-dodecil-szulfát-oldattal hígítjuk, és a fehérjét 5:2 arányú kloroform izoamilalkohol eleggyel végzett többszöri extrahálással eltávolítjuk. A vizes fázist 15 C°-onkb. 1 ml-re bepároljuk, és dializáló edényben 3 C°-on 48 órán át 0,01 mólos 35 trisz-(hidroximetil)-aminometán-hidroklorid pufferoldattal szemben dializáljuk. Poli-ribo-adenilil-2,4-ditio-uridilsavat kapunk. Hozam: 97%; S20 jW érték: 12 S; UV-spektrum (vízben, pH = 7,0): Xmax . = 280 nm és 340 nm, A280/A340 - 1,90. A termék ultraibolya 40 spektrumában 0 C° és 100 C° között nem észlelhető helix-spirál átalakulás, ennek megfelelően a polinukleotid valószínűleg spirálformában van jelen. A példában előállított polimer tartalmaz olyan molekulákat is, ahol n + m = 2000. 45 d) 0,001 mmól (21 A270 -egység) poli-2,4-ditio-uridin-5'-foszfát és 1 ml 0,1 mólos foszfátpuffer (pH = 7,4) elegyéhez 3 C°-on 0,001 mmól jódot (0,01 ml 0,1 n vizes jódoldatot) adunk. Az elegyet 2 órán át 3 C°-on tartjuk, majd dializáló edényben 3 C°-on, 15 50 órán át 0,05 mólos trisz-(hidroximetil)-aminometánhidroklorid pufferoldattal (pH = 7,0) szemben dializáljuk. Poli-2,4-ditio-uridin-5'-foszfát-diszulfidot kapunk. Hozam: 93%; S20 , w érték: 17 S; UV-spektrum (vízben, pH = 5,5): Xmax = 288 nm (e p = 30000) és 55 340 nm (ep = 2800). Hasonlóan állítjuk elő a poli-ribo-adenilil-2,4-ditio-uridilsavból a megfelelő diszulfidot. Hozam: 96%; S20 w érték: 15 S; UV-spektrum (vízben, pH = 5,5): Xmax. 280 nm (ep = 15000) és 340 nm (e p = 1400). 60 e) 5 mmól 2,4-ditio-uridin-5'-difoszfát-dinátriumsó 2 ml vízzel készített oldatához 0,02 ml 3:1 térfogatarányú 1 m Na2 S0 3 -oldat és 1 m NaHS03 -oldat elegyét adjuk. A reakcióelegyen levegőt áramoltatunk ; át, és 30 perces időközönként az elegyhez 0,02 ml 65 szilfit-reagenst adunk. A reakció menetét vékonyré-4
