165070. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antitrombin III.elkülönítésére vérből és vérfrakciókból adszorpció útján

165070 3 módszerünkkel az antitrombin III. több, mint 90%-os hozammal különíthető el. Azt találtuk, hogy az antitrombin III. a fentiekben említett magas hozammal különíthető el, ha adszorbensként szulfatált szénhidrátokat használunk. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás antitrombin III. elkülönítésére vérből a vérfrakcióból adszorpció útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy adszorbensként szulfatált szénhidrátokat használunk. Kísérleteket folytattunk szulfatált szénhidrátokat tartalmazó gélek, mint adszorbensek felhasználásával vérplazmából a vér koagulálását előidéző anyagok elkülönítésére. Meglepetésszerűen azt találtuk, hogy adott esetben a gélhez speciális koagulációs faktorok kapcsolódnak. Az adszorpció útján elkülönített anyag gélszűréssel végzett további szeparálása lehetővé teszi egy olyan, mintegy 65 000 molekulasúlyú komponens izolálását, mely kifejezetten koagulálásgátló hatású. E fehérjén végzett fiziko-kémiai és immunológiai vizsgálatok alapján megállapítható, hogy a fehérje megegyezik a korábban már ismertetett antitrombin III fehérjével [Klin. Wochenschr. 45,404-409(1967)].; Oszlopkromatográfiás vizsgálatokkal megállapítottuk, hogy antitrombin közvetlenül is előállítható, minthogy ezzel az eljárással a kiindulási anyag más fehérjéitől elkülöníthető. Nagy mennyiségű antitrombin előállítására célszerűnek bizonyul, ha az úgynevezett Cohn-frakció IV-oldatához (J. Am. Chem. Soc. 68, p. 459, 1946, 6 eljárás) adszorbensként gélt adunk. Az adszorpció után a gélt leszűrjük, mossuk és eluáljuk. Az eluátumot ezután Sephadex Gl50 márkanevű (gyártó cég: Pharmacia Fine Shemicals, Uppsala, Svédország) gélszűrőn átszűrjük és így teljesen tiszta antitrombint kapunk. Adszorbensként például az alábbi géleket használjuk: 1. térhálósított dextránszulfát, 2. térhálósított dextránszulfát-agaróz, 3. térhálósított heparin, 4. térhálósított heparin-agaróz, és 5. térhálósított kondroitin-szulfát-agaróz. A térhálósított egykomponensű 1. és 3. géleket úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő poliszacharid oldatához brómciánt adunk. Az oldat pH értékét ezután 11-re állítjuk be, amikoris a térhálósodás a molekulák között végbemegy és így gél képződik. A kétkomponensű 2., 4. és 5. géleket úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő szulfatált poliszacharidhoz agarózgélt adunk (Sephadex 4B; gyártó cég: Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország), majd a kapott keverék pH értékét 1 l-re beállítva a keverékhez brómciánt adunk. Ezek a géltípusok könnyen kezelhetők és az egykomponensű géleknél nagyobb átfolyási sebességet eredményeznek. A találmányt a következő példákkal közelebbről megvilágítjuk. 1. példa 100 ml dextránszulfát (20 mg/ml) oldathoz 5 g 4 brómciánt adunk. Az oldat pH értékét ezután 5 mólos nátriumhidroxid-oldat adagolása útján 7 percen át 11-n tartjuk és a keveréket keverés mellett éjszakán át állni hagyjuk. Paszta-konzisztenciájú fehér darabos 5 gél képződik. A pasztát 5 mm átmérőjű és 8 cm hosszú kromatográfiás oszlopba töltjük, és az oszlop egyensúlyi állapotának elérésére az oszlopot 0,02 mólos TRISZ-, majd 0,01 mólos citrát-oldattal és 8,5 pH értékű 0,15 mólos nátriumklorid-pufférrel kezel-10 jük. Ezt követően az oszlopon 2 ml normál vérplazmát engedünk keresztül. Az oszlopon történt áthaladása után a plazma elveszíti koaguláló képességét. Az oszlopot először az eredeti pufferrel mossuk, majd 1 mól nátriumklorid koncentrációig fokozatosan nö-15 vekvő koncentrációjú NaCl-oldatokkal eluáljuk. Az eluátum olyan anyagot tartalmaz, mely a normál plazma rekalcifikálás után mért koagulációs idejét foszfát-pufferrel szemben végzett dialízis után 3 percről 45 percre növeli. Immunológiai vizsgálatok 20 kimutatják az antitrombin III. és bizonyos lipoproteinek jelenlétét az eluátumban. 2. példa Térhálósított dextránszulfát-agaróz géllel végzett 25 adszorpciós vérplazmából A térhálósított adszorbenst úgy állítjuk elő, hogy 30 ml dextránszulfát-oldatot (15 mg/ml), 50 ni 4%-os gyöngypolimerizált agarózt és 1 g brómciánt 11-es pH-értéken összekeverünk. Ezután a kapott 30 keveréket keverés mellett 7 percen át állni hagyjuk és a pH értéket állandó szinten tartjuk nátriumhidroxid folyamatos adagolása útján. Ezt követően a bázis adagolását beszüntetjük, amikoris a pH értéke 5 percen belül 8,5-re csökken, majd a keverést szoba-35 hőmérsékleten 1 éjszakán át folytatjuk, végül a kapott gélt mossuk. Az így kapott géllel megtoltunk egy kromatográfiás oszlopot. Az adszorpciós művelet során 3 ml normál vérplazma és puffer (0,02 mólos TRISZ, 0,01 mólos citrátoldat, 0,15 mólos nátrium-40 klorid-oldat, pH 8,5) 1:1 arányú elegyét engedjük keresztül az oszlopon. Az oszlopon történt áthaladása után az eluátumot 3 ml térfogatra koncentráljuk és megvizsgáljuk koaguláló képességét. Megállapítható, hogy az oszlopon történt áthaladása során a plazma 45 elvesztette koaguláló képességét, és mentes az úgynevezett VIII és IX koaguláló faktoroktól. Az oszlopon adszorbeálódott anyagot 0,02 mólos TRISZ-oldattal és 0,01 mólos citrát-oldattal (pH 7,3) deszorbeáljuk, legalább 0,15 mólos nátriumklorid-oldatra vonatkoz-50 tátott sógradienssel. Az eluátum a kiindulási anyag 2%-ának felel meg és lényegében két komponenst, így egy pre-béta-típusú lipoprotein frakciót és antitrombin IH-at tartalmaz. Ez utóbbi anyagok azonosítása immunológiai és fiziko-kémiai vizsgálatokkal történik. 55 3. példa Térhálósított dextránszulfát-agaróz géllel végzett adszorpció, gélszűrés A 2. példában ismertetett módon az adszorpciós 60 lépést dextránszulfát - agaróz gél használatával 2