165070. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antitrombin III.elkülönítésére vérből és vérfrakciókból adszorpció útján

165070 5 végezzük. A deszorpciót egy lépésben 0,02 mólos TRISZ, 0,01 mólos nátrium-citrát-oldat és 1 mólos nátriumklorid-oldat pH = 7,3 értékű elegyével végezzük. A deszorbeált anyagot koncentráljuk és fiziológiás foszfát-pufferben Sephadex Gl50 márkanevű gélszűrőn gélszűrésnek vetjük alá. A lipoprotein-frakáótól tökéletesen elkülönített tiszta antitrombin III.-t kapunk. 4. példa Térhálósított heparin-agaróz géllel végzett adszorpció vérplazmából A heparin-agaróz gélt a 2. példában ismertetett módon állítjuk elő, dextránszulfát helyett 30 ml heparin-oldatot használunk (5000 IU/ml). Az így kapott géllel megtoltunk egy kromatográfiás oszlopot és a kísérletet a továbbiakban a 2. példában leírt módon végezzük. A kapott eredmények megegyeznek a 2. példában ismertetettekkel. 5. példa Plazma fehérjék adszorpciója dextránszulfát-agaróz gélen a Cohn frakció IV-ből, gélszűrés Immunológiai módszerekkel bizonyítható, hogy a Cohn frakció IV antitrombin III.-t tartalmaz. 135 g paszta-konzisztenciájú IV. frakciót 4 liter adszorpciós pufferben feloldunk és a kapott oldathoz 500 ml dextránszulfát-agaróz gélt adunk. A kapott keveréket hűtés alkalmazásával 1 órán át enyhén keverjük, majd az oldatot dekantáljuk és a gélt adszorpciós pufferrel mossuk. A gélt ezután ioncserélő oszlopba töltjük és fokozatosan növekvő NaCl-koncentrációjú 7,2 pH értékű TRISZ-pufferrel eluáljuk (0,05 mólos, 1 mólos, 1,5 mólos oldatok). A lipoproteint és antitrombin III.-t tartalmazó eluátumot ultraszűrés útján koncentráljuk és ezután Sephadex Gl50 márkanevű gélszűrővel tisztítjuk. A kapott anyagok azonosítása és tisztaságuk vizsgálata immunológiai és fizikokémiai módszerekkel történik. 6 6. példa Kondroitin-szulfát-agaróz gélt állítunk elő 250 mg kondroitin-szulfát VI, 40 ml 4%-os gyöngypolimerizált agaróz és 1 g brómcián pH 11 értéken végzett 5 összekeverése útján. A kapott keveréket pH 11 értéken 7 percen át tartjuk úgy, hogy a pH állandó értéken tartására folyamatosan nátriumhidroxid-oldatot adagolunk. Csak kis mennyiségű bázisra van szükség és 7 perc után a pH értéket óvatosan 8,5-re csökkentjük 10 ecetsav adagolása útján. A keverést ezen a pH-értéken szobahőmérsékleten egy éjszakán át folytatjuk, majd a kapott gélt mossuk. Kromatográfiás oszlopot a kapott géllel megtoltunk, és a fentiekben ismertetett körülmények között 1:1 arányban hígított 3 ml 15 plazmát bocsájtunk keresztül az oszlopon. Az antitrombin III. a gélből az 1. példában ismertetett eluáló pufferrel eluálható. 20 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás antitrombin III. elkülönítésére vérből és vérfrakciókból adszorpció útján, azzal jellemezve, hogy adszorbensként szulfatált szénhidrátokat hasz-25 nálunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy adszorbensként gélszerű mátrixhoz, célszerűen agarózhoz vagy dextrán gélhez kötött vagy például térhálósítás útján oldhatat-30 lanná tett szulfatált szénhidrátot használunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja,azzal jellemezve, hogy adszorbensként szulfatált poliszacharidokat használunk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási 35 módja, azzal jellemezve, hogy adszorbensként brómciánnal térhálósított szulfatált poliszacharidokat, így dextrán-szulfátot, dextrán-agarózt vagy heparinagarózt használunk. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 75-1367 - Dabasi Nyomda, Budapest - Dabas 3