164997. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(D-alfa-amino-alfa -fenil-acetilamino)-3-metil-CEF-3-ÉM-4-karbonsav enzimes előállítására
7 164997 8 sejtszuszpenziót rávisszük a vivőanyagra, ügyelve a pH-ra, mivel az ionerősség nagy mértékben befolyásolja az adszorpciót. Az acflező enzimet vagy mikrobasejteket adszorbeáló vivőanyag, vagyis a szilárd fázisú enzimkészítmény esetében fennáll a denaturálás vagy dezaktiválás veszélye, ezért az enzimkészítményt nedves állapotban kell eltartani. A továbbiakban a 7-ADCA-t szilárd fázisú enzimkészítmény jelenlétében D-fenilglicinnel vagy annak egy származékával reagáltatjuk. Bár a szúbsztrátum koncentrációja főleg az enzim erősségétől vagy az oszlopon való áthaladás sebességétől függően változhat, előnyös, ha meghatározzuk ezt, nehogy a nem reagált 7-ADCA és fenilglicin mennyisége növekedjék a távozó folyadékban. A 7-ADCA koncentrációja általában 0,1-2%, előnyösen 0,2-1%, és a feiulgncin vagy fenilglicinszármazék a 7—ADCA-hoz viszonyítva 2-10-szeres moláris feleslegben van jelen. Az acflező reakciót az enzim hatékonysága tekintetében legkedvezőbb pH-nál és hőmérsékleten hajtjuk végre. Az oszlopos műveletben a reakció időtartamát a kifolyó szúbsztrátum térfogatának változtatásával lehet szabályozni. A reakció általában végbemehet azalatt, amíg az anyag a szilárd enzimkészítmény oszlopon végighalad, és a szúbsztrátum folyamatos hozzáadásával könnyen folyamatosság lehet tenni a műveletet. Ha azonban a távozó folyadékban szubsztrátumot találunk, az átfolyást lassítani kell, vagy a távozó folyadékot újra át kell vezetni az oszlopon. Amikor az enzim aktivitása csökken vagy az enzim kimerül, természetesen be kell fejezni a műveletet. Az így előállított cefalexint ismert módszerekkel különítjük el. Például a reakciókeveréket anioncserélő gyantára vagy aktív szénre visszük fel, majd vizes savoldattal vagy szerves oldószer-víz eleggyel eluáljuk, és a cefalexint tartalmazó távozó folyadékot bepárolva izoelektromosan kicsapjuk. Vagy másképpen: a reakciókeverék pH-ját trifluorecetsav hozzáadásával l-re állítjuk be, majd szerves oldószerrel, például metilizobutilketonnal extraháljuk, és a savtartalmú vízzel való oldás után izoelektromosan kicsapjuk. Ezenkívül a reakciókeveréket vízzel nem elegyedő szerves oldószer jelenlétében anioncserélő gyantával kezeljük, és a vizes réteget bepároljuk, vagy liofilizáljuk, hogy a cefalexint szabad savként elkülönítsük. A cefalexin meghatározása A cefalexint tartalmazó vizsgálandó oldatot mikrobiológiailag papírkorong módszerrel vagy csésze módszerrel Bacillus subtüis PCI-219-cel szemben, 16 óra hosszat 37 C°-on inkubálva határozzuk meg. A keletkezett gátlási zónát mérjük, és ezáltal a cefalexin standard görbéjéből kiszámítjuk a cefalexin titerét. 1. példa 3% glükózt, 1% élesztőkivonatot, 0,1% dikáliumhidrogénfoszfátot, 0,05% magnéziumszulfát 7H2 0-t, 0,05% káliumkloridot és 0,001% vas(II)szulfátot tartalmazó 100 ml térfogatú 7 pH-jú vizet 120 C°-on 20 percig sterilizálunk. Ezt a táptalajt beoltjuk Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 mikroorganizmussal, és lengő mozgatással rázatva 26 C°-on 72 óra hosszat inkubáljuk. A tenyészet pH-ját 6,5-re állítjuk be, majd 2 mg/ml 5 7-ADCA-t és 20 mg/ml D-fenilglicin-metilészter-hidrokloridot tartalmazó 100 ml 0,1 mólos, 6,5 pH-jú foszfátpufferoldatot adunk hozzá, és 3 óra hosszat 37 C°-on tartva reagáltatjuk az enzimmel. A reakciókeverék szüredékében a cefalexint meghatározva a 10 kitermelést 100%-osnak találjuk. A szüredéket fluoreszceint tartalmazó kovasavgél vékonyréteg kromatografáló lemezre cseppentjük, és n-butanol, ecetsav és víz 3:1:1 arányú oldószerrendszerrel kifejlesztjük a kromatogramot. 15 Ultraibolya fényben megfigyelve 25 36 A-nél bíborvörös folt látható 0,50 Rf érték közelében, a folt a bioautografiával meghatározott hiteles minta foltjával azonos. 20 2. példa Az 1. példát megismételjük Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 helyett a következő mikroorganizmusokkal: Törzs Keletkezett cefalexin Alcaligenes faecalis ATCC 8750 15% Flavobacterium aquatile NRRL B-5394 24% Beneckea hiperoptica ATCC 15803 100% 3. példa 3% glükózt, 1% élesztőkivonatot, 0,1% dikáliumhidrogénfoszfátot, 0,05% magnéziumszulfát.7 H2 0-t, 0,05% káliumkloridot és 0,001% vas(II)szulfátot tartalmazó, 7,0 pH-jú 1,3 liter táptalajt 120 C°-on 20 percig sterilizálunk, majd 100 ml-es részletekben aszeptikusán 500 ml-es lombikokba töltjük, Achromobacter B—402-2 törzzsel beoltjuk, és 26 C°-on 72 óra hosszat lengető rázás közben inkubáljuk. 1 liter fermentlét centrifugálunk, és az így kapott eredeti állapotú sejteket fiziológiás nátriumklorid oldattal kétszer mossuk, majd 1,2 liter 0,1 mólos 6,5 pH-jú foszfátpufferoldatban szuszpendáljuk. Éhhez a szuszpenzióhoz 5 mg/ml 7-ADCA-t és 50 mg/ml D-fenilglicin-metilészter-hidrokloridot tartalmazó 400 ml vizes oldatot adunk, és a keveréket 37 C°-on 2 óra hosszat inkubáljuk. A reakciókeverékben a cefalexint meghatározva, a kitermelést 98,8%-osnak találjuk. 4. példa A 3. pejda eljárását megismételjük Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 helyett a következő mikroorganizmusokkal. Törzs Keletkezett cefalexin 65 Alcaligenes faecalis ATCC 8750 15% Flavobacterium aquatile NRRL B-5394 23% Beneckea hiperoptica ATCC 15803 99% 4
