164997. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(D-alfa-amino-alfa -fenil-acetilamino)-3-metil-CEF-3-ÉM-4-karbonsav enzimes előállítására

g 164997 10 5. példa 3% glükózt, 1% élesztőkivonatot, 0,1% dikáliumhidrogénfoszfátot, 0,05% magnéziumszulfát.7 H2

0-t, 0,05% káliumkloridot és 0,001% vas(II) szulfátot tartalmazó, 7,0 pH-jú vizes táptalajt beoltunk Beneckea hiperoptica ATCC 15803 törzzsel és 26 C°-on 72 óra hosszat lengető rázás közben inkubáljuk. 1 liter fermentlét centrifugálunk, és az összegyűjtött eredeti állapotú sejteket fiziológiás nátriumkloridoldattal kétszer mossuk, majd centrifugáljuk, és 1 liter desztillált vízben szuszpendáljuk. Ezután 8 liter acetont adunk hozzá, és így acetonnal szárított baktériumport kapunk. 165 mg ilyen baktériumport 5 ml 6,5 pH-jú 0,1 mólos foszfátpufferoldatban szuszpendálunk, 2 ml 5 mg/ml koncentrációjú vizes 7—ADCA oldatot, 2 ml 50 mg/ml koncentrációjú D-fenilglicin- metilészter-hidroklorid oldatot és annyi 6,5 pH-jú 0,1 mólos foszfát-pufferoldatot adunk hozzá, hogy a reakciókeverék térfogata 100 ml legyen, és 37 C°-on 90 percig inkubáljuk. A reakciókeverékben keletkezett cefalexint meghatározva 90,5% kitermelést állapíthatunk meg. 6. példa Az 5. példa szerint előállított 500 mg Achromobacter B—402-2 acetonnal szárított sejtport 100 ml 6,5 pH-jú 0,1 mólos foszfátpufferoldatban szuszpendálunk, majd 50 ml 4 mg/ml koncentrációjú vizes 7-ADCA oldatot és 50 ml 20 mg/ml koncentrációjú vizes D-fenilglicin-metilészteroldatot adunk hozzá. 37 C°-on való 2 órai inkubálás után a reakciókeveréket centrifugálva a felülúszó folyadékban 1260 7/ml cefalexint kapunk: kitermelés 80,3%. A felülúszó folyadékot acetát fázisú Dowex 2 anioncserélő gyantával töltött 2 x 20 cm méretű oszlopra töltjük, vízzel való mosás után 400 ml átfolyt oldat pH-ját 8,0-ra állítjuk be, és újra feltöltjük egy 2 x 15 cm méretű acetát fázisú Dowex 2 anioncserélő gyanta oszlopra, majd 0,05 mólos ecetsavval eluáljuk. Minden 15 ml térfogatú frakciót vékonyrétegkromatograiálással ellenőrzünk, és a cefalexint tartalmazó frakciókat összegyűjtve és liofilizálva 490 mg cefalexin port kapunk. Ultraibolya abszorpciós spektrografálással ezt a port 60%-os tisztaságúnak találjuk. A szárított port izoelektromos kicsapással tisztítva 294 mg fehér port kapunk. Hozam 90%: tisztaság 98%-os: teljes kitermelés 88%. 7. példa A) 3% glükózt, 1% élesztőkivonatot, 0,1% dikáliumhidroeénfos/fátot. O.O'W magnéziumszulfát.7 H2

0-t, 0,05% káliumkloridot és 0,001% vas(II)szulfátot tartalmazó, 7,U pH-jú 20 liter vizes táptalajt 30 literes fermentáló edénybe töltünk, és 120 C°-on 20 percig sterilizáljuk. Ezt a táptalajt beoltjuk ugyanilyen táptalajban előzőleg tenyésztett Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 (FERM-P 1095) mikroorganizmus 400 ml tenyészetével, és percenként 20 liter levegőztetés és percenként 300 fordulatú keverés közben, 26 C°-on 72 óra hosszat inkubáljuk. A fermentálás után a baktériumsejteket centrifugálással összegyűjtjük, fiziológiás konyhasóoldattal kétszer mossuk, és így 170 g nedves eredeti állapotú sejtet kapunk. B) Az A) szakaszban kapott 3 g eredeti állapotú 5 sejtet; 100 ml 6,0 pH-jú 0,1 mólos acetátpufferoldatban szuszpendáljuk. Ezt a szuszpenziót 0 C°-on keverés közben hozzáadjuk 180 g DEAE-cellulózt tartalmazó 1,5 liter 0,1 mólos acetátpufferoldathoz. 6 óra állás után szilárd enzimkészítményt kapunk. 10 Ezt az enzimkészítményt 3,5 x 47,5 cm méretű oszlopra töltjük, és 24 óra alatt 0,1% 7—ADCA—t és 0,5% D-fenüglicin-metilészter- hidrokloridot tartalmazó 12 liter, 6,0 pH-jú 0,1 mólos acetátpufferoldatot folyatunk át rajta. 15 Az így kapott 12 liter eluátumot a cefalexin adszorbeálására 120 g aktív szénnel töltött 7,2 x 13 cm méretű oszlopon folyatjuk át, majd az adszorbenst vízzel mossuk, és 1:1 arányú aceton és 0,5 n ecetsav eleggyel eluáljuk. 20 A cefalexint tartalmazó 1 liter aktív frakciót vákuumban bepároljuk, és a száraz maradékot víz és acetonitril elegyéből átkristályosítva a cefalexint elkülönítjük. Meleg vízzel mosva és megszárítva 12,3 g kristályos terméket kapunk 60%-os kitermeléssel. 25 Kovasavgél vékonyrétegen kromatografálva a termék egyetlen foltot mutat. MNR spektrumát a hiteles mintáéval összehasonlítva a vegyület azonosnak bizonyul. Bioautografiával és ultraibolya abszorpciós mód-30 szerrel meghatározva tisztasága 90%. 8. példa 35 H A 7. példa A) szakasza szerinti eljárásban kapott 40 g eredeti állapotú sejtet 30 ml desztillált vízben szuszpendálunk, majd 1 liter acetont hozzáadva és a keveréket szűrőn elválasztva 10 g acetonnal szárított 40 sejtet kapunk. 160 mg szárított Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 (FERM-P 1095) sejtet 4 ml 6,0 pH-jú 0,1 mólos acetátpufferoldatban szuszpendálunk, és keverés közben hozzáadjuk 10 g DEAE-cellulózt tártai-45 mázó 20 ml 6,0 pH-jú 0,1 mólos acetátpufferoldathoz. 6 órai állás után a mikróbasejteket adszorbeált vivőanyagot, vagyis a szilárd enzimkészítményt 1 x 26 cm méretű oszlopba töltjük, 6,0 pH-jú 0,1 mólos acetátpuffer-oldattal mossuk, és 5 óra alatt 0,1% 50 7-ADCA-t és 0,5% D-fenilglicin-metilészter- hidrokloridot tartalmazó 100 ml 0,1 mólos 6,0 pH-jú acetátpuffer-olatot vezetünk át rajta. Az eluátumban cefalexinként meghatározott acilezési arány 85%. 9. példa A 8 példát1

megismételjük, de a DEAF-cellulÓ7 helyett a következő vivőanyagokat alkalmazzuk: Vivőanyag Keletkezett cefalexin CM-cellulóz 40% TEAE-cellulóz 80% 5