164986. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új acth-jellegű polipeptidek előállítására
15 164986 16 3 g a (4-2) eljárással előállított terméket vízmentes hidrogénfluoriddal kezelünk, és az 1. példa 6. pontjában leit módszerrel tisztítjuk. Termelés 1,7 g (acetát) R£ = 0,55; Papírelektroforézis pH 1,9-en (ecetsav-hangyasav puffer, 500 V, 60 perc) = 9,0 cm; 5 (= Albu * -a1 "»t- kortikotiopÉi) \a]fö = -8,1* (c = 1,0,1%-os ecetsavban). Aminosavanalízis: (5,7 n sósav, 110 C° 24 órás 10 hidrolizátum): Lys 3,9 (4), His 1,0 (1), Ser 1,0 (1), Arg 2,9 (3), Glu 1,0 (1), Pro 2,9 (3), Gly 2,0 (2), Albu 0,9 (1), Val 2,8 (3), Met 0,9 (1), Tyr 1,9 (2), Phe 1,0 (1). A vegyületet az önmagukban ismert módszerekkel a megfelelő hidrokloridjává alakíthat- 15 jukát. 4. példa 20 (1) BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-NH-NH2 4,13 g H-Tyr-Ser-Met-OCH3 vegyületből, 100 ml acetonitrilből és 10 ml dimetilformamidból készített oldathoz keverés közben, 0 C°-on, 2,3 g 25 BOC-Sar-OH vegyületet és 2,3 g diciklohexilkarbodiimidet adunk. Az elegyet 24 óráig 0 C°-on és további 10 órán át 20 C -on keverjük. A keletkezett diciklohexilkarbamidot szűréssel távolítjuk el, majd a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot 30 forró etilacetátban oldjuk, és az oldatot 4%-os nátriumhidrogénkarbonátoldattal és vízzel mossuk. A mosott oldatot kis térfogatra pároljuk, majd a visszamaradt elegyhez étert adunk. A kicsapódott terméket leszűrjük, és metanol-éter elegyből 35 átkristályosítva 4,8 g termék keletkezik. (R£ = 0,3). A terméket forró metanol-dimetilformamid elegyben oldjuk, és ehhez az oldathoz 2 ml hidrazinhidrátot adunk. Az elegyet ezután leszűrjük, és a szüredéket vízzel ét etanollal mosva 4,3 g 40 hidrazidot kapunk. Rí- = 0,0,Rr = 0,55. (2) OtBu I 45 BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH 900 mg BOC-Sar-Tyr-Ser-Met- NH-NH2 vegyületből, 10 ml dimetilformamidból és 4 ml 1 n sósavoldatból készített oldathoz 1,7 ml 1 n 50 nátriumnitrit oldatot adunk 0 C°-on, és az elegyet 5 percig keverjük. A reakcióelegyhez ezután jéghideg etilacetátot és 50 ml jéghideg telített vizes nátriumkloridoldatot adunk. A vizes fázist kétszer jéghideg etilacetáttal extraháljuk. Az összes szerves 55 fázist egyesítjük, jéghideg 4%-os vizes nátriumhidrogénkarbonátoldattal mossuk, és nátriumszulfát felett szárítjuk. A száraz oldatot Xg H-Glu-His-Phe-Arg-Try-Giy- OH acetátból, 0,4 ml trietilaminból, és 30 ml dimetilformamidból készített oldathoz adjuk, és az etilacetátot vákuumban 10 C°-on lepároljuk az elegyből. A maradék oldatot 12 65 órán át 3 C°-on keverjük. A reakcióelegyhez további azidoldatot adunk (melyet 500 mg BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-NH-NH2 -ből készítettünk a fentiekben leírtak szerint) és még 24 órán át 5 C°-on keverjük. Ezután a reakcióelegyet 500 ml jéghideg etilacetáttal hígítva amorf csapadékot kapunk. A csapadékot leszűrjük és dimetilformamidmetanol elegyből átkristályosítva tisztított terméket kapunk. Termelés 1,4 gt [a]|j = -19,0° (c = 1 dimetilformamidban) R| = 0,30, R| = 0,75. (3) H-Sar-Tyr-Ser- Met-Glu-His-Phe- Arg-Try-Gly-LvS" Pro* »Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-NH2 acetát A> OtBu I 0,74 g BOC-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu -His-Phe-Arg-Try-Gly-OH vegyület áímetilformamidos oldatához 0 C°-on 0,5 ml jéghideg 1 n sósavoldatot adunk. A hidrokloridot 500 ml jéghideg etilacetát hozzáadásával csapjuk ki. A csapadékot lecentrifugáljuk, és etilacetáttal mossuk, majd vákuumban szárítjuk. A keletkezett port 50 ml dimetilformamid és 20 ml piridin elegyében oldjuk és az elegyhez 1,1 g BOC BOC BOC ! I I H-Lys -Pro-Val-Gly-Lys-Lys -Arg-Arg-Pro-Val-NH2 tozilátsót, majd 400 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk, és 4 napig 10 C°-on keverjük. Ezután reakcióelegyet vákuumban 20 ml-re pároljuk be, 500 ml etilacetátot hozzáadva egy amorf csapadékot képezünk, amelyet lecentrifugálunk és etilacetáttal és éterrel mosunk. Az anyagot 50 tf-tf% vizes tetrahidrofuránban oldjuk, és az oldatot Amberlite IRA-400 (3 x 30 cm) oszlopon engedjük át, és ugyanezzel az eleggyel eluáljuk. Az oldószert lepároljuk, és a vizes oldatot liofilizálva 1,92 g pelyhes port kapunk. 100 mg ilyen eikozapeptidet, melyben a szabad amino- és karboxilcsoportok védettek, 2 ml 90%-os trifluorecetsavban oldunk, és az oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. A trifluorecetsavat lepároljuk, a maradékot vízben oldjuk, és az oldatot 0,5 x 20 cm-es Amberlite IRA-400 (acetát formájú) oszlopon engedjük át. Az eluátumot 10 ml vízben oldjuk és 1 x 20 cm-ei karboxünetikettuloz oszlopon engedjük át, melyet ammóniumacetátpufferes gradiens elucióval eluálunk, pH 6,8 értéken 0,1-től 1 mól-os koncentrációig. A tiszta eikozapeptidacetátot kb 03 mól-oa pwmnű eluáljuk. Az eluátumot vákuumban kú térfogatra pároljuk be, majd súlyállandóságig liofilizá^uk. Termelés 70 mg, [a] ^ - -61* (c •= 0,5 1%-os ecettavban), R| = 0,0,Rj = 0,5 (Sar1 -a 1 -2 £ kortikotropin-Val 2 ° -NH2 ) 5. példa (1) BOC-Albu-Tyr-NH-NH2 23 g H-Tyr-OCHj .HCl és 14 ml trietilamin 400 ml acetonitriles oldatához 20 g BOC-Albu-OH vegyületet és 22 g diciklohexilkarbodiimidet adunk 0 C°-on és az oldatot ezen a hőmérsékleten keverjük 24 óráig. Miután a reakcióelegyet leszűrtük, a szűrletet szárazra 8
