164986. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új acth-jellegű polipeptidek előállítására
11 164986 12 OtBu N02 Z I I I Z-Sar-Tyr- Ser-Met-Glu-His-Phe- Arg-Try-Gly- Lys-Pro-Val- 5 Z Z N02 N0 2 Z I I I I I Gly-LysLys-Arg-Arg-Pro- Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH vegyületet, 10 és 25 ml hidrogénfluorid bevezetése után a rendszert 3 C°-on 50 percig keverjük. A hidrogénfluoridot csökkentett nyomáson le desztilláljuk, és a maradékot vákuumexszikkátorban, szilárd nátriumhidroxid felett 15 szárítjuk. A száraz maradékot 30 ml vízben oldjuk, és az oldatot 2 x 30 cm méretű Amberlite IRA-400 (acetát formájú) oszlopon futtatjuk. Az effluenset egyesítjük a mosófolyadékokkal, és körülbelül 20 ml-re pároljuk 20 be, továbbá 0,2 ml tioglikolsavat adunk hozzá. A rendszert 12 órán át 50 C°on melegítjük és az oldatot vízzel 200 ml-re hígítjuk. Az oldatot ezután 2 x 40 cm-es karboximetilcellulóz oszlopon futtatjuk, melyet előzőleg 0.1 mólos ammóniumacetátoldattal 25 mostunk, majd gradiens eluciót végzünk, 0,1 és 0,5 mólos novekvó sókoncentrációk között. A kívánt polipeptid körülbelül a 0,2 és 0,3 mól közötti frakciókban jelentkezik, melyeket egyesítünk és liofilizálunk Az eljárással 350 mg Sar'-o1 " 2 -4 10 kortikotroptnt kapunk acetátként, [a] j^5 =-77,2 (c 0,51, 1% ecetsavban). Papírelektroforézis (pH 1,9) '',3 cm. A termékkel beoltott patkányok jelentős szteroid kiválasztást mutattak. 35 2. példa 40 (1) N02 Z I I Z-Sar-Tyr-Ser-Met-Glu- His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys- Pro-Val- 45 Z Z N02 N0 2 Z I I I I I Gly-Lys-Lys-Arg-Arg- Pro-Val-Lys -Val-Tyr-NH2 140 mg (0,3 mmol) Z-Sar-Tyr-Ser-NH-NH 2 0,2 ml 50 6 n HCl és dimetilformamid elegyével készített oldatához 0,1 mól nátriumnitritet adunk 4 n oldatként, -10 C° hőmérsékleten, és az elegyet 30 percig ezen a hőmérsékleten keverjük. A reakcióelegyet 0,17 ml trietÜaminnal semlegesítjük és vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk. Az azidoldatot leszűrjük és a szűrletet 60 N02 Z Z I I I H-Met-Glu-His-Phe-Arg -Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-N02 N0 2 Z I I I -Arg-Arg -Pro-Val-Lys -Val-Tyr-NH 2 hideg dimetilformamidos oldatához adjuk, melyet 665 mg (0,2 mmól) OtBu N02 Z I I I BOC-Met-Glu- His-Phe- Arg-Try-Gly- Lys-Pro-Val-Gly-Z Z I I -Lys-Lys-N02 N0 2 Z I I I -Arg-Arg- Pro-Val-Lys- Val-Tyr-NH 2 vegyületből állítottunk elő, az ismert módszer szerint trifluorecetsavat alkalmazva. Az elegyet 6 órán át -10 C°-on keverjük, majd még 10 órán át 0 C°-on, 60 mg hidrazidból azidot képzünk, a fentiekben leírtak szerint, és ennek oldatát adjuk a reakcióelegyhez. A reakcióelegyet 24 órán át 0 C°-on állni hagyjuk, mialatt a kívánt terméket jéggel hűtött éter hozzáadásával (50 ml) kicsapva finom port kapunk. A port leszűrjük, és szilikagéles oszlopon a szokásos módon tisztítjuk. Termelés 630 mg (85%, op.: 205-210 C°) (bomlás közben), (170-180 C°-on zsugorodás), [a|jQ = -31° (c = 0,5 dimetilformamidban), R| = 0,6, F| = 0,74, R\ = 0,90. Analízis a C176 H 2 3 704 6 N 43 S.4H 2 0 képlet alapján: számított: C = 55,6%, H = 6,5%, N = 163%, S = 0,87%. mért: C = 55,4%, H = 6,5%, N = 16,0%,S = 0,87%. (2) H-Sar-Tyr-Ser-Met- Glu-His-Phe- Arg-Try-Gly-Lys- Pro-Val-Gly-Lys-Lys- Arg-Arg-Pro- Val-Lys-Val-Tyr-NH 2 acetát 500 mg, 2. példa (1) pontja szerinti védett trikozapeptid, 0,75 ml anizol, 0,05 ml tioglikolsav, 1500 mg metionin, 750 mg triptofán és 2 ml trifluorecetsav elegyét 60 percig 0 C°-on keverjük, majd a visszamaradó hidrofénfiuoridot éstiifluocecetsavat csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot 25 ml vízben oldjuk, és az oldatot háromszor 20-20 ml vízzel mossuk. A vizes fázist 75 ml Amberlite IRA-400 (acetát formájú) oszlopon engedjük át, és az oszlopot 0,1 térfogatszázalék vizes ecetsavoldattal mossuk. Az összes effluenset csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 10 ml 1 súlyszázalékos vizes tioglikolsavoldattal oldjuk, és az oldatot 12 órán át 50 C°-on tartjuk, nitrogéngáz alatt. A keletkezett oldatot 400 ml vízzel hígítjuk, és 2,5 x 20 cm méretű karboxilmetilcellulózoszlopra visszük fel, melyet 500 ml 0,1 mól pH 6,5 ammóniumacetátpufferrel, 500 ml 0,1 mól pH 6,5 ammóniumacetátpufferrel és 500 ml 0,15 mól ammóniumacetátpufferrel eluálunk, ebben a sorrendben. Ezután a kívánt Sar'-a1 " 2 - kortikotropin-Tyr23 -NH 2 -t 300 ml 0,4 mo! pH b,5 ammóniumacetátpufferrel eluárjuk. Az eluátumot liofilizáljuk, így 31U mg színtelen pelyhe* port kapunk, acetátként, [a]jQ = -74,0° (c = 0,5, 1 % vizes ecetsavban),
