164979. lajstromszámú szabadalom • Eljárás benzodiazepin-származékok előállítására mikrobiológiai transzformációval

17 164979 18 fluormetil- l,3-dihidro-2H- 1,4-benzodiazepin- 2-ont kapunk, 2:7 súlyarányban. A termékek infravörös spektruma azonos a megfelelő vegyületek infravörös spektrumával. 6. példa Az 1. példa szerinti eljárást ismételjük meg azzal a különbséggel, hogy Streptomyces chartreusis FERM-P 946 törzset tenyésztünk és a tenyészetekhez 2 ml térfogatban 100 mg, ultrahanggal szuszpendált szubsztrátot, 5-fenil-7-kiór- 1,3-dihídro- 2H-l,4-benzodíazepin-2-ont adunk. Az 1. példában megadott összetételű táptalajjal és az adagolt szubsztráttal ultrahang segítségével finom eloszlású szuszpenziót készítünk. Az 1. példa szerinti módon extraháljuk a tenyészetet, amikor 1,97 g súlyú, nyers kristályos terméket kapunk. A 2. példa szerinti módon elkülönítjük, majd tisztítjuk a nyers termékei, amikor 202-203 C° olvadáspontú 3-hidroxi-5-fenil- 7-klór- 1,3-dihidro-2H- 1,4- benzodiazepm-2-ont kapunk. A példa szerinti eljárással előállított termék infravörös spektruma a megfelelő vegyületekkel azonos. 7. példa Streptomyces globisporus FERM-P 948 torzsét tenyésztünk 100 ml, az 1. példában megadott összetételű táptalajon, 500 ml-es Sakaguchí-lornbíkokhan A kinőtt tenyészet 60 ml-ével-H0 liter hasznos térfogatú laboratóriumi üvegfermentorban stenlezeti 6 1. a fenti összetételű táptalajt oltunk. A tenyészetet 30 C° hőmérsékleten, levegőztetés és keverés közben inkubáljuk. 24 órás inkubáció után 6 g. etanolban oldott 3-metil-5-(2'-klórfenil)-7-klór- 1,3- dihidro-2H- 3.4-benzodiazepin-2-ont adunk a táptalajhoz. 6 napos tenyésztés után az 1. példa szerinti eljárással extrahál juk a reakcióelegyet, amikor 5,84 g nyers, kristályos terméket kapunk. A nyers termék elkülönítését és tisztítását a 2. példa szerinti eljárással végezzük, amikor 0,78 g 197-200 C° olvadáspontú l-metil-3-hidroxi- 5-(2'klórfennil)-7-klór- l,3-dihidro-2H- 1,4-benzodiazepin-2-ont és 5,01 g 165 167 C° olvadáspontú 3-hÍdroxi-5-(2'-klórfenil)-7-klór- 1,3-dihidro-2H- 1,4-benzodiazepin-2-ont kapunk. A példa szerinti eljárással előállított vegyületek infravörös abszorpciós spektruma a megfelelő vegyületekéve! azonos. 8. példa Streptomyces benzodiazepinicus FERM—P 949 inokulumával három, 100—100 ml, az 1. példában megadott összetételű táptalajt oltunk, amelyet Sakaguchi-lombikban előzőleg sterilezünk. Két napos inkubáció után 10 mg, etanolban oldott 5-fenil-7-trifluormetil- l,3-dihidro-2H- 1,4- benzodiazepin-2-ont adunk mindegyik lombikhoz. Harminc órán át inkubáljuk a tenyészetet, majd a micéliumokat szűréssel elkülönítjük, pH 7,0-es 0,05 M-os foszfát pufferral mossuk és 50 ml, 0,1% glükózt tartalmazó, a fentivel azonos pufferban szuszpendál-5 juk. Az így készült micéliumos szuszpenzióhoz 2 ml, 100 mg 5-fenil-7-trifluormetil- 1,3-dfliidro- 2H- 1,4-benzodiazepin-2-ont és 0,1% glükózt tartalmazó foszfát pufferral készült és ultrahangos eljárással kezelt 10 finom eloszlású szuszpenziót adunk. A tenyészetet ezt követően Monod rázóasztalon nyomnyi mennyiségű toluol adagolása után 28 C°-on inkubáljuk. 20 órás inkubáció után a reakcióelegyet kloroformmal extraháljuk. A nyers terméket a 2. példa 15 szerinti módon tiszitjuk, amikor 189—191 C° olvadáspontú 3-hidroxi- 5-fenil-7-trifluormetil- 1,3-düiidro-2H- 1,4-benzodiazepin-2-ont kapunk. 2o 9. példa Streptomyces albidoflavus ATTC 15833 spóraszuszpenziójával 500 ml-es Sakaguchi-lombikokban 100—100 ml, a következő összetételű táptalajt ol-25 tunk: glukóz 1 g, polipepton 0,2 g, húskivonat 0,1 g, élesztőkivonat 0,1 g, csapvíz 100 ml. A táptalaj pH-ját 7,0-re állítjuk be. A tenyészeteket síkrázógépen 30 C° hőmérsékleten 24 órán át inkubáljuk. Ezt követően 100 mg, 2,0 ml etanolban oldott 5-fenil-7-nitro-3Q l,3-dihidro-2H- 1,4-benzodiazepin-2-ont adunk a táptalajokba. További hat napos inkubáció után kloroformmal extraháljuk a reakcióelegyet, az extraktumot csökkentett nyomáson szárazra desztilláljuk. Az így kapott, 97 mg súlyú nyers, kristályos terméket a 2. 35 példa szerinti eljárással tisztítjuk, a tisztított terméket etanolból kikristályosítjuk. így 3-hidroxi-5-fenil- 7-nitro- l,3-dihidro-2H- 1,4-benzodiazepin-2-ont kapunk. A terméket a megfelelő vegyület infravörös abszorpciós spektrumával összehasonlítva azonosí-4Q tottuk. 10. példa 4& A 9. példában megadott összetételű táptalajon Streptomyces flavus ATCC 3369 jelű organizmust tenyésztünk. 24 órás inkubáció után 2—2 ml inokulummal Sakaguchi-lombikokban sterüezett, 100—100 ml, a fenti összetételű táptalajt oltunk. A növekedés 50 befejeződése után mindegyik táptalajhoz 100 mg, 2,0 ml etanolban oldott 5-(2'-fluorfenil)-7-klór- 1,3-dihidro- 2H- 1,4-benzodiazepin-2-ont adunk. Hat napos tenyésztés után a táptalajt '•»kloroformmal extraháljuk, majd az 1. példában leírt eljárást megismételve 55 755 mg nyers, kristályos terméket kapunk. A nyers terméket a 2. példa szerinti eljárással tisztítjuk, amikor 101 104 (*° olvadáspontú 3-hidroxi- 5-(2'fluorfrnin 7-klór-l,3-dihidro-2H-l,4-benzodiazepui-2--ont kapunk. "*• * •. . .i.e. a megleielo veg> mellei azonos intra-voros abszorpciós spektrummal rendelkezik. 11. példa 65 Az 1. példa szerinti, Streptomyces griseus IFO 3102 törzzsel végzett fermentációt ismételjük meg, 9