164928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-(szubsztituált hidrazono-metil) rifamicin SV származékok előállítására
3 bői, dioxánból, tetrahidrofuránból, benzolból és klórozott szénhidrogénekből átkristályosithatők. Szerves oldószerekbenvalő oldhatóságuk természetesen az Rés Rj csoportok típusától és terjedelmétől függ. Ha savas csoportok vannak jelen, akkor a 5 vegyületek vizben is oldhatók, az alkáliföldfémsókhoz hasonlóan. A találmány szerint előállított vegyületek jó antibakteriális hatást fejtenek ki a Gram-pozitiv és Gram-negativ baktériumokkal szemben. Az uj ve- 10 gyliletcsoport különösen a Staphylococcus aureus törzsekkel szemben mutat figyelemreméltó hatást. Ez esetben a minimális gátlókoncentráció kb. 0,001-0, 05/tg/ml-ig terjed. A vegyületek 1-50 ju<g/ml-es koncentrációban ha- 15 tékonyak az olyan Staphylococcus aureus törzsekkel szemben is, amelyek más, ismert rifamicinekkel szemben ellenállóak. Az uj vegyületek toxicitása igen kicsi. A találmány szerint előállított vegyületek másik 20 fontos tulajdonsága azok gátló hatása DNS-polimerázokra, amelyek leukaemias emberi vér lymphoblastjaira jellemzők, valamint vírusok tipikus nukleotidil-transzferázaira, amelyeket normális sejtek nem használnak. Viruscsoportok tipikus tagjai- 25 nak vizsgálataiból ismeretes, hogy reprodukciójuk lényeges részeként a gazdasejtekbe polimerázokat szállítanak, vagy azokban ilyeneket létrehoznak. így, vannak olyan virusok, például a picornavirusok vagy a policvirusok, amelyek RNS-függő RNS- 30 polimerázokat hoznak létre, mig más csoportok, mint a leukaemia-sarcoma virusok RNS-függő DNS-polimerázokat hordoznak. Az RNS-függő DNS-polimerázok (reverz-transzkriptázok) jelenlétét és igen fontos szerepét a tumort képező RNS vírusokban D. 35 Baltimore [Nature, 226, 1209 (1970)] és H.M. Temin és társai [Nature, 226, 1211 (1970)] fedezték fel. Azt az ujkeietü felfedezést, hogy RNS-függő DNS-polimeráz-enzimek vannak állatfajták RNS tu- ^0 rnorvírusaiban, más szerzők is megerősítették, amint az például az alábbi irodalomfelsorolásból is kitűnik: Green et al.: Mechanism of carciogenesis by RNA tumor viruses. I. An RNA-dependent DNA-po- 45 limerase in murine sarcoma viruses, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 385-393 (1970); Spiegelman et al.: Characterization of the products of RNA directed DNA-polimerase in oncogenic RNA viruses, Nature (London), 227. 563(1970); 50 Hatanaka et al.: DNA polimerase activity associated with RNA tumor viruses, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 143 (1970); • Scolnick et al.: DNA synthesis by RNA contain- _ ing tumor viruses, Proc. Nat. A.cad. Sei. USA, 67, 1034 (1970), RNS vírusoknak bizonyos tumorokban való jelenlétét más tények is alátámasztják: reverz-transzkriptázt találtak olyan asszonyok tejének részecskéiben, akiknek családjában mellrák fordult elő és °ü akik zárt családi körön belül házasodtak [Seholn és társai: Nature, 231, 97(1971)]. Priori és társai [Nature New Biology, 232, 16 (1971)] egy reverz-transzkriptázt tartalmazó, ESP> l-nek nevezett vírust izoláltak egy nyirokmirigy da-4 ganatos gyermek mellhártyafolyadékának sejtjeiből és szövetkulturán sikeresen tenyésztették. Az egér emlőtumor-virusával homológ RNS jelenlétét emberi mellrákban R. Axel és társai mutatták ki molekuláris hibridizációs kisérletekkel [Nature, 235,' 32 (1972]. Az emberi mellrákvirus, létezésének lehetőségét emberi tej elektronmikroszkópos vizsgálatával is alátámasztották [N. H. Sarkar és társai, Nature, 236, 103 (1972). RNS-függő DNS-polimeráz aktivitást észleltek és virusszerű részecskéket izoláltak emberi rhabdomyosarcoma sejtjeiből is [McAllister és társai, Nature, New Biol. 235, 3(1972)]. Jelenleg nincsenek kellően hatásos gyógyszerek a virusbetegségek kezelésére, mivel a virusok és a sejtek anyagcserekövetelményei és mozgáspályái azonosak. A virusos kemoterápiához vezető legtöbbet igérő ut olyan megfelelő vegyszerek kidolgozása, amelyek specifikusan a virusos vagy vírus-transzformált sejtpolimerázokkal egyesülnek, de nem egyesülnek a gazdasejt-polimerázokkal, amelyek a virusok genetikus információjának képletét szabályozzák. A virusos vagy virus-transzformált sejtenzimek specifikus inhibitorai, főleg az RNS tumorvirus-polimerázok inhibitorai fontos szerepet játszhatnak,mert a leukaemiai és más rákos terápia gyógyszereinek bizonyultak. A találmány szerinti vegyületek gátló hatását egér sarcomavirus (endogén) RNS-függő DNS-polimerázán és tisztított enzimek DNS-függő DNS polimer áz-aktivitásán vizsgáltuk. A gátló hatást a C. Gurgo és társai [Nature, New Biology, 229, 111 (1971)] által leirt módszerek szerint vizsgáltuk. A különböző gyógyszerkoncentrációknak a polimerázaktívltásra kifejtett hatását ugy határoztuk meg, hogy 3H-dTTP-nak (tritiummal jelzett tlmíndezoxiribozid trifoszfát) az oldhatatlan fázisba való beépülését követtük. A kísérleti eljárások egy tipikus példáját a következőkben mutatjuk be. Virus izolálása és virusos po l imeráz tisztítása Virust az előzőekben leirt módon Green és társai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 385, 393 (1970), Rokutanda és társai, Nature, 22 7, 1026-1028 (1970) egér sarcomavirus (Moloney izolátum) által transzformált patkánysejtekből (78A1 sejtek) és egér sarcomavirus által transzformált egérsejtekből (MEH sejtek) izoláltunk és tisztítottunk. A. virion-polimerázt 20-40-szeresen tisztítottuk ugyfhogy a tisztított virust 0,1 mólos nátriumklorid-oldatban levő 0,5% NP-40 (nonidet P-40), 0,01 mólos triszpuffer (pH = 7, 6) és 0, 001 mólos EDTA. keverékében szobahőmérsékleten 5 percig inkubáltuk és 15-30% szacharóz gradiensben, 10 mmólos nátrium-foszfát puffer (pH = 7,4), 2, 5 mmólos magnéziumklorid, 10 mmólos ditiotreit és 5% glicerin keverékében 24 óráig 38 000-es fordulatszámmal egy Spinco SW41 rotorban zónás centrifugál ás nak vetettük alá. A 22 összegyűjtött frakcióból az enzimaktivitás csucsfrakciőit összegyűjtöttük és -70 °C-on, 30% glicerinben tároltuk. DNS polimeráz elemzés Az enzim inkubációját a Greenés társai által le-2
