164928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-(szubsztituált hidrazono-metil) rifamicin SV származékok előállítására

164928 5 6 irt módon [Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 385-393 (1970)] 1 óráig, 37°C-on, 100 ml olyan reakciőkeverékben végeztük, amely 40 mmől trisz-puffert (pH = 8, 0), 5 mmól ditiotreitet, 30 mmól nátriumkloridot, 2,5 mmól magnéziumkloridot, 0,1 mmől dATP-t, aderozin-dezoxiribozid-trifoszfát), dGTP-t (guanin- dezoxiribozid-trifoszfát), dCTP-t (citidin-dezoxiribozid-trifoszfát) és 10f»-Ci H-dTTP-t (12-18 Ci/mmól) tartalmazott. A. reakciót 150/4.1 1 n perklórsav hozzáadásával fejeztük be. Borjuthymus-DNS-t (100/tg) adtunk hozzá hordozóként; a radioaktiv DNS terméket a fent emiitett két irodalomban leirtak szerint kezeltük. Az endogén RNS-fUggő DNS-polimeráz aktivitást 0, 01% NP-40-nek a tisztitott vírushoz való hozzáadása után a vizsgálat időpontjában mértük. A. tisztitott virusos polimeráz DNS-polimeráz aktivitását 2/x.g poli-d (A-T) templáttal, NP-40 nélkül mértük. Rifamicin származékok gátló hatásának vizsgálata A rifamicin származékokat 5 mg /ml-es koncentrációban dimetilszulfoxidban (DMSO) oldottuk és 40 C-on tároltuk. Az endogén RNS-fUggő DNS-polimeráz aktivitást ugy vizsgáltuk, hogy DMSO-ban megfelelően oldott 20/1-1 származékot vagy 20,0-1 DMSO-t (kontroll) adtunk a vizsgálati keverékhez a 15-30yU-g virusos proteint tartalmazó szétroncsolt virus hozzáadása előtt. Az enziminkubálást 60 percig 37°C-on végeztük. A tisztitott enzim gátló hatását ugy vizsgáltuk, hogy 20/zl származékot vagy DMSO-t 30/i.l enzimmel (1-2^-g protein) 10 percig 37°C -on előinkubáltunk; ezután 70^.1 szubsztrátum keveréket adtunk hozzá, majd a keveréket tovább inkubáltuk és az előbbiekben leirtak szerint kezeltük. Reprezentatív vizsgálatokban a találmány szerinti vegyületek 2-100/tg/ml vagy ennél kisebb koncentrációban a 3

H-dTTP beépülését 10%-nál kisebb értékre csökkentették, mint amit a kontrollvizsgálatoknál találtunk, világosan bebizonyítva az RNS tumorvirusok által okozott rákfejlődés mechanizmusára gyakorolt gátló hatást, a legújabb biokémiai szemléletnek megfelelően. A. reverz-transzkriptázokgátlóhatását egér leukémia-virus-polimerázon végzett vizsgálattal is igazoltuk. Az egér leukémia-virus RNS polimerázát Trión X 100 szétroncsolt virionokból preparáltuk, Gallo és társai leírása szerint [[Gallo és társai, Nature, New Biology, 232, 141 (1971)]. Mind a Rauscher, mind a Moloney tipusu vírusokat előzetesen oly módon tisztítottuk, hogy megkötöttük azokat szacharóz 1,16 g/ml fajsulygrádiensU tartományában frakcionálás utján, miután előzetesen kis sebességű centrifugálással a sejttörmeléket eltávolítottuk, és a felüluszót 60 és 20% közötti szacharóz gradienssel tisztítottuk. A viruspreparáciő végső koncentrációja ló-*-* részecske/ml volt. Templátként endogén 70S RNS-t alkalmaztunk. Az enzim gátlása szempontjából az 50/jig/ml vagy ennél kisebb koncentrációt találtuk hatásosnak. Emberi eredetű tumorsejt-polimerázok használatánál hasonló eredményeket kaptunk. Ez esetben a gátló hatást normál sejtpolimerázokon is tanulmányoztuk, hogy a szelektív hatást jellemezzük. Az 1 általános képletnek megfelelő rifamicin származékok hatását két tisztitott DNS-polimerázon értékeltük, amelyeket 1. emberi normál (PHA stimulált) vér lymphocitákból, 2. lymphoblast sejttenyészetből (normál donortól származó) és 3. emberi leukae-5 miás vér lymphoblastjaiböl izoláltunk. Szintetikus és/vagy természetes terápiátokat használtunk. A. kísérleti eljárás egy jellegzetes példáját az alábbiakban ismertetjük: X0 Emberi vér lymphoblastok Leukaemias lymphoblastokát leukophoresis által előidézett acut lymphocitás leukaemiában (ALL) szenvedő betegek perifériás véréből izoláltunk. A sejteket átmostuk és hipotóniás lizissel eltávoli-15 tottuk az erythrocitakat. Normál lymphocitakat egészséges donorok perifériás véréből nyertünk, miután a granulocytákat nylon oszlopkromatográfiával eltávolítottuk. Phytohemagglutininnel (PHA) stimuláltuk őket 72 órán át az előzőekben leirtak 20 szerint [Gallo és társai, Nature, 228, 927(1970); Gallo és társai, Science, 165, 400 (1968)], hogy a DNS-polimeráz aktivitást a maximálisra növeljük. Ezeknek a sejteknek elegendő nagy mennyiségbenvaló előállítása azonban problémát jelent, ezért 25 a kezdeti tájékozódó vizsgálatok céljaira emberi "normál" szövet-sejttenyészetekből (1788) nyertünk kevésbé tisztitott polimerázokat. Az érdekesnek bizonyuló vegyületeket ezután részletes ebben tanulmányoztuk normál és leukaemias vér lymphocyták-30 ból származó erősebbentisztitott enzimekkel. Ezeket a szövettenyészet-sejteket az Associated Biochemie Systems, Inc. bocsátotta rendelkezésünkre. DNS-polimeráz készítmények 35 Sejt DNS-polimerázokat extraháltunk és tisztítottunk normál vér (PHA-val stimulált) lymphocytákból, leukaemias vér lymphocytáiból és 1788 lymphoid sejtekből, hipotóniás pufferoldatban való homogenízálással, ezt követte az extralizozomális 40 részecskék Triton X 100-zal és/vagy erős sós extrahálással végzett kivonása. Differenciál - centrifugálás után a sejt-extraktumokat DEAE-cellulózos, foszfocellulőzos és Sephadex G 200-as oszlopkromatográfiával tovább tisztítottuk. 45 DNS-polimeráz vizsgálatok A DNS-polimeráz vizsgálatokat 100ptl végsőtérfogatban végeztük. A vizsgálati keverék 50 mmől trisz-puffert, pH =8,3, 6, 0 mmől magnéziumace-50 tatot, 8, 0 mmől ditiotreitet és 60 mmől nátriumkloridot tartalmazott. A. pH beállítását előzőleg dimetilszulfoxidban (DMSO) oldott inhibitorok hozzáadásával végeztük. A DMSO végső koncentrációja 0,5% volt, s minden kontrollminta is tartalmazta 55 ezt a DMSO mennyiséget. A vizsgálatban olyan enzimkoncentráciőt alkalmaztunk, ami kb. 1,0 pmól/óra beépülést katalizál. Az enzimet a legtöbb esetben 5 percig előinkubáltuk az inhibitor vegyülettel. A reakciót ezután templát beadagolásával 60 iniciáltuk: vagy szintetikus DNS-t (poly d(AT) Miles Lab.) és DNS. RNS hibridet (oligo dT. polyrA) 5 fig/ml koncentrációban vagy természetes temptátokat: aktivált lazacsperma DNS-t 50ju.g/ml koncentrációban és endogén 70S virusos RNS-t alkal-65 máztunk; továbbá 10p.Ci (3

H-metil)-TTP-t (New 3