164918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dextranáz előállítására

7 164918 8 pott oldathoz 1 ml 0,05 mólos, 7,5 pH-értékű, 1 suly% dextránt tartalmazó trisz-pufferoldatot adunk és a reakció lefolytatása céljából 37 °C hőmérsékleten 20 percig állni hagyjuk; ugyanilyen kísérletei íolytatunk le, egyébként azonos körülmények között, 45 °C, 53 °C illetőleg 60 °C hőmérsékleten is. A reakció folyamán képződött redukáló cukor menynyiségét 3,5-dinitro-szalicilsavval meghatározzuk; az így kapott értékből következtethetünk az enzimnek az illető hőmérsékleten mutatott aktivitására. A kapott eredményeket a 2. ábrán szemléltetjük; ebből megállapítható, hogy a találmány szerint előállított dextranáz-enzimnek a dextránnal szembeni aktivitása szempontjából az optimális hőmérséklet 53 °C körül van. 7. Stabilizáló pH-tartomány. 30 egység/mg aktivitású poralaku enzimet desztillált vizben oldunk 1 mg/ml koncentrációban, majd ugyanilyen mennyiségű 0,05 mólos, 5,0 pH-értékü ecetsav-pufferoldatot, 6,0-7,5 pH-értékU foszforsav-pufferoldatot, 7,0-8,5 pH-értékü trisz-pufferoldatot, illetőleg 9,0-10,0 pH-értékU bórsav-pufferoldatot adunk hozzá. A reakcióelegyet azután 24 óra hosszat 37 °C hőmérsékleten tartjuk és pH-értékét a szükséghez képest nátrium-hidroxid-oldattal illetőleg sósavoldattal 7,5 körülire állítjuk be. Végül a reakcióelegyet 0,05 mólos trisz-pufferoldat hozzáadásával ötszörös térfogatra hígítjuk. Az oldat megmaradt aktivitását ezután a már említett 3,5-dinitro-szaiicüsavas módszerrel meghatározzuk. A kapott eredményeket a 3. ábra mutatja; 4,3 és 11,0 pH-érték között a visszamaradó enzimaktivitás minden pH-értéken legalább 80% volt; a 7 és 9 közötti pH-tartományban a visszamaradó enzimaktivitás elérte a 100%-ot. 8. Hőhatással szembeni stabilitás. 30 egység/mg aktivitású poralaku enzimet desztillált vizben oldunk 1 mg/ml koncentrációban. 0,5 ml ilyen enzim-oldatot termosztáttal szabályozott állandó hőmérsékletű fürdőben 10 percig 40°C, 50°C, 60°C, 63°C, 65°C, 68°C illetőleg 70°C hőmérsékleten tartunk. Ezután 1 ml 0,05 mólos, 7,5 pH-értékU, 1 suly% dextránt tartalmazó triszpufferoldatot adunk mindegyik kísérletben a melegitőfürdőből történő kivétel után azonnal lehütött oldathoz és a reakcióelegyet 20 percig 37°C hőmérsékleten tartjuk. Az enzim-oldatnak az ily módon történő kezelés után megmaradt enzim-aktivitását a már emiitett 3,5-dinitro-szalicilsavas módszerrel meghatározzuk. A kapott eredményeket a 4. ábra szemlélteti, amelyből látható, hogy 7Ö°C hőmérsékleten a dextranáz 20 perc alatt elveszíti hővel szembeni stabilitását; a stabilitás legnagyobb mértékű megtartását 57°C alatti hőmérsékleten tapasztaljuk. 9. Fém-ionokkai szembeni stabilitás: Zn-, Hg- és/vagy Cu-ionok jelenléte semmilyen káros hatást nem gyakorol az enzim aktivitására. 10. A hatáserősség mérése. 0,5 ml enzim-oldathoz 1 ml 0,05 mólos, 7,5 pH-értéku, 1 suly% dextránt (molekulasúly: 5 000 000 - 20 000 Ü00) tartalmazó trisz-pufferoldatot adunk és a reakcióelegyet a reakció teljes lefolyásának biztosítása érdekében 20 percig 37°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután a már emiitett 3,5--dinitro-szalicilsavas módszerrel meghatározzuk a képződött redukáló cukor mennyiségét; ebből következtethetünk az enzim-oldat megmaradt aktivi-5 tására. Az enzim hatáserősségének egységéként azt a redukáló cukor-mennyiséget tekintjük, amely óránként 1 mg maltőznak felel meg. A találmány szerinti eljárással előállított dex-10 tranáz-enzim optimális pH-értéke tehát 8,0 körül, vagyis a gyengén alkalikus tartományban van, ellentétben az eddig ismert eljárással előállított, szokásos minőségű dextranázzal, amely a savas pH-tartományban mutat optimális hatást. Ez a tu-X5 lajdonság igen fontos előnyt jelent a találmány szerint előállított dextrán esetében, mert lehetővé teszi az igy előállított dextranáznak a fogászat. Illetőleg fogápolás terén történő alkalmazását, különösen a fogak romlásának megelőzése céljából. 2o A találmány szerint előállított dextranáz felhasználható továbbá plazma-pótszerként is. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik, megjegyzendő azonban, hogy a találmány kö-25 re nincsen ezekre a példákra korlátozva. 1. példa 30 Egy Sakaguchi-lombikba beviszünk 50 mi alábbi összetételű, 8,5-pH-értékü folyékony tápközeget: dextrán 1 c<uíy% polipepton 1 suly% élesztőkivonat 0,05 suly% 35 kálium-dihidrogén-foszfát 0,1 stüy% dikálium-hidrogén-foszfát 0,1 suly% magnézium-szulfát-heptahidrát 0,1 suly% mangán-szulfát-hexahidrát 0,005 suly% kalcium-klorid 0,002 suly% 40 Ezt a tápközeget 120 °C hőmérsékleten történő 20 perces gőzöléssel sterilizáljuk, majd beoltjuk egy olyan inokulum-kultúra 3 térfogat%~nyi menynyiségével, amelyet ugyanilyen összetételű folyékony táptalajon, Brevibacterium fuscum var. dex-45 tranlyticum FERM-P 513 mikroorganizmus-törzs 30°C hőmérsékleten 20 óra hosszat történő tenyésztése utján állítottunk elő. A steril körülmények között történő beoltás után a fermentációt 26 C hőmérsékleten 60 óra hosszat folytatjuk, per-50 cenként 130 kilengéssel, 7 cm amplitúdójú lökettel dolgozó rázóasztalon. 10 azonos körülmények között lefolytatott ilyen fermentáció termékét egyesítjük és 3000 g~nek megfelelő fordulatszámmal centrifugáljuk. A kapott 55 450 ml tiszta fermentációs levet elkülönítjük; e fermentlé 200 egység/mg dextranáz-aktivitást mutat. A centrifugált fermentlevet 40 C hőmérsékleten csökkentett nyomáson eredeti térfogatának 1/5 ré-60 szere betüméuyitjtik, majd fél térfogat acetont adunk hoazá. Az igy kapott elegyet újból centrifugáljuk és a tiszta folyadékfázishoz 1,5 térfogat acetont acunk. majd ismét centrifugáljuk. A centrifugálássat leválasztott és elkülönített szilárd ter-65 mékeí aceton hozzáadása utján víztelenítjük; ily 4