164918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dextranáz előállítására
5 164918 6 A fermentációs hőmérséklet előnyösen 20-30°C, célszerűen 24-27 °C lehet. A tenyésztés időtartama általában 2-4 nap. A fermentációt akkor kell megszüntetni, amikor a dextranáz-termelés eléri a maximumot. Bár a pH-érték a fermentáció folyamán általában átmenetileg kissé csökken, többnyire nem szükséges külön gondoskodni a pH-érték korrekciójáról. Előnyös azonban, ha a fermentáció kezdeti szakaszában a pH-értéket mintegy 8-9-re állitjuk be. Amikor a termék mennyisége az előbb emiitett módon elér egy bizonyos maximális értéket, a dextranázt a fermentléből a fermentált enzimek elkülönítésére általánosan ismert módszerek valamelyikével különíthetjük el. A termék tisztitasa is önmagukban ismert módszerekkel történhet. Eljárhatunk például ugy, hogy csökkentett nyomáson megszűrjük vagy centrifugáljuk a fermentlevet.vagy más alkalmas módon különitjük el a mikroorganizmus-testeket. Az ily módon kapott szürletet vagy annak extraktumát ezután bepároljuk vagy valamely oldható só, például konyhasó vagy ammóniumszulfit hozzáadásával csapjuk ki a terméket. Eljárhatunk ugy is, hogy vizzel elegyedő szerves oldószert, mint metanolt» etanolt, acetont vagy hasonlót adunk a leszűrt fermentléhez, a nyers dextranaz kicsapása céljából. Ez utóbbit ezután vizben oldjuk és az oldatot a kisebb molekulasúlyú szennyeződések eltávolítása céljából dializisnekvetjük alá. A kisebb molekulasúlyú szennyeződéseket és színezőanyagokat a szokásos adszorpciós kromatográfiai módszerekkel távolithatjuk el, vagy alkalmazhatunk ioncserélő kromatográfiai vagy gélszürést is. Az ily módon kapott enzimoldatot csökkentett nyomáson történő szűréssel, liofilizálással vagy hasonló módszerekkel dolgozhatjuk fel tovább, a nyers dextranaz kinyerése céljából. Az igy szilárd anyagként vagy oldatban kapott dextranaz további tisztitasa adszorbensek alkalmazásával és/vagy gél-szűréssel történhet, amint ez a fehérjék, enzimek vagy hasonló termékek tisztítása esetében szokásos. Eljárhatunk például ugy, hogy nyers dextranaz vizes oldatához gél-szűrésre alkalmas szert, például "Biogel" készitményt adunk a tisztitott dextranaz elválasztása vagy kioldása céljából. Ugy is eljárhatunk, hogy az oldathoz valamely megfelelő adszorbenst, például karboximetil-cellulózt vagy dietilamino-etil-cellulózt adunk, majd a koncentráció-gradiens alapján szelektíven eluálunk és végül dializáljuk a terméket. A nyers dextranaz tehát önmagukban ismert módszerek, mint oldás, adszorpció, eluálás, gélszürés, mosás, dializis, llofilizálás, ioncserés adszorpció, bepárlás vagy ezek valamely kombinációja utján dolgozható fel és tisztitható tovább. A találmány szerint előállított tisztitott dextranaz az alábbi fizikai és kémiai tulajdonságokat mutatja: 1. Elemi analízis: erre a célra az 5. példa szerint előállított enzímport alkalmaztuk; az eredmény: C: 35,9%, H: 4,61%, N: 6,70%. 2. Molekulasúly: "Biogel P 30" alkalmazásával történő" oszlopkromatográfia alapján: 43.000 körül. 3. Hatása: Az enzim az exo-alaku dextrán cC-1,6-glükozid-kötéseit megbontja ugy, hogy végül izomaltóz keletkezik. E tény kimutatása céljából a kapott dextranáz-enzimet dextránnal kevertük és folyamatosan mértük a viszkozitást. Ekkor PZ idő múlásával meglehetősen hirtelen esést mutat a viszkozitási görbe; az emiitett viszkozitás-esés megjelenésekor mértük a redukáló cukor képződését, amely lineáris tendenciát mutatott, 4. Specifikus hatás: az enzim a dextránt bontja, de poliszacharidokra, például az 1,4-kötéseket tartalmazó dextrinre semmiféle hatása nincs. 5. Optimális pH-értékek: a) A cukrositó hatás szempontjából: 30 egység/mg aktivitású poralaku enzimet desztillált vizben oldunk 1 mg/ml koncentrációban. 0,5 ml igy kapott enzim-oldathoz 1 ml különböző pH-értékü pufferoldatokat adunk, amelyekhez előzőleg 1 suly% dextránt adtunk. A következő pufferoldatokat alkalmazzuk: 0,05 mólos, 5,0 pH~értékü ecetsav-pufferoldat, 6,0-7,5 pH-értékü foszforsav-pufferoldat, 7,0-8,5 pH-értékü trisz-pufferoldat, 9,0-10,0 pH-értékü bórsav-pufferoldat. Az igy pufferezett elegyet 20 percig 37 °C hőmérsékleten tartjuk, majd a reakció folyamán képződött redukáló cukor mennyiségét 3,5-dinitro-szalicilsavval meghatározzuk, A képződött redukáló cukor mennyisége alapján megítélhető a cukrositó hatás szempontjából optimális pH-érték. b) Elfolyósitó hatás: Egy Ostwald-féle viszkoziméterbe, amelynek cseppenési időtartama 37 °C hőmérsékletű desztillált viz esetében 8,3 mp és amelyet 37 °C hőmérsékletre melegitünk a kisériet megkezdése eiőtt, beadagolunk 5 ml 0,05 mólos, a fent megadottakkal egyező összetételű és pH-értékű, 1 suiy% dextránt tartalmazó pufferoldatot, majd 3ö egység/mg aktivitású poralaku enzimből készített, 4 mg/ml koncentrációjú enzim-oldatot adunK hozzá 0,3 ml mennyiségben. Percenkén: merjUK a cseppenési időtartamot. Az elfolyósitó hatást (sp ) az alábbi képlet alapján számitjuk ki: t - t o ; = . P £o Ha az Sp-érték l/sp reciprokat az idővel szembeni függvényként ábrázollak, lineáris ósszemggésí kapunk. Egyenes arányosság ált fem: a lineáris görbe emelkedése és a dextranaz aktivitás között; ennek alapján a hatáserősség meghatározható. Az igy kapott eredményeket az 1. ábra mutatja, amelyből megállapítható, hogy a találmány szerint előállított dextranáznak a dextránnal szembeni aktivitása szempontjából az optimális pH-érték 8,0 körül van. 6. Optimális hőmérséklet: 30 egység/mg aktivitású poralaku enzimet 0,05 mólos, 7,5 pH-értékü trisz-pufferoldatban oldunk, 1 mg/ml koncentrációban, majd 0,5 mi igy ka-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
