164816. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyarozs-alkaloidok, főként ergokriptin és ergokornin fermentációs előállítására
3 164816 4 10 15 20 25 30 45 50 táptalajon 30 napos kiemelkedő, sugaiasan 56 60 65 szacharóz citromsav nátriumklorid amnióniumnitrát káliumdihulrogénfoszfát 100,0 g 10,0 g 10.0 g 1,0 g 0,3 g 70 nap eljárásokban nem utalnak, sőt a szekunder anyagcsere biztosítását célzó növekedés-gátlást az eljárások többsége a táptalaj alacsony foszfor tartalmával (0,25 g káliumdihidrogénfoszfát/liter) éri el. A kevés foszfor néhány nap alatt elfogy a táptalajból, a növekedés lelassul, de ugyanakkor a foszfor hiányában erős pigmentképződés indul meg (például a 150.631 és a 152.238 számú magyar szabadalmi leírások szerint.). A fenti hátrányok kiküszöbölésére olyan Claviceps purpurea törzs izolálását tűztük ki célul, mely valamely peptid-típusu alkaloid fermentáció termelésére képes és emellett azzal az előnnyel jár, hogy szervetlen nitrogénforrást jól hasznosít, emelt foszfor mennyiséget tartalmazó táptalajon is termel alkaloidot és végül alkaloidképzése gyors, a tenyészet alkaloidszintje 6-7. napon megközelíti az elérhető maximumot. Ilyen törzsek izolálására a következőképp járunk el magas alkaloidtartalmú szklerociumbol a Claviceps purpurea törzset kitenyésztjük, ebből három átoltási lépést ismétlő ciklusokban szelekcióval fokozatosan dúsítjuk fel a cél szerinti variánst. Az egyes átoltási ciklusokban szilárd táptalajról levett telepekkel folyékony táptalajon oltótenyészetet állítunk elő, erről tovább oltva alkaloidtermelő folyékony tenyészetet készítünk, melynek anyagát ismét szilárd táptalajra visszük. Valamennyi táptalajhoz ammóníumnitrátot adagolunk, a gomba csökkenő érzékenysége szerint növekvő, 1,0 10,0 g/liter mennyiségben A/ alkaloid termelő tenyésztés folyékony táptalajához 0,5 g liter káliumdihidrogénfoszfátot adunk, ugyanezen táptalajt a korábbi eljárásunk szerinti 20,0 g/liter nátriumklorid adalékkal is kiegészítjük (153.739 számú magyar szabadalmi leírás). A szilárd táptalajról az éles szélű, kúposán elemelkedő, konidiumot nem képe/.ő telepeket választjuk ki. az alkaloidtermelő folyékony tenyészetek közül pedig azokat oltjuk viss/a szilárd táptalajra, melyeknél a 6 7 napon legmagasabb a/ sere. alkaloidszínt és ezen belül legkedvezőbb a peptidtípusú alkaloidok hányada. Az emelt foszforkoncentráció mellett az alkaloidképzéshez szükséges növekedesgátlást a nátriumklorid adalék biztosítja. A vázolt eljárással törzset izoláltunk, mely ergokriptin és ergokornin termelésére képes Haviceps purpurea variáns, a kívánt előnyó- tulajdonságok birtokában. Az előállított torzsét az Országos Közegészségügyi Intézetnél 88/1972 számon letétbe helyeztük, azonosíthatósága érdekében az alábbi morfológiai és biokémiai jellemzést adjuk: Telepmorfológia SC 101 inknbálás után: 25-30 mm éles szélű, ráncolt telep, felülete bársonyos, szine fehér, közepe világos drapp, a telep hátoldala barnás. A telep az agar felületéről nehezen választható le, konzisztenciája kemény. Konidiumképzés nincs. Mikroszkópos vizsgálatban a telepet alkotó sejtek főtömege duzzadt, rövid, erősen szemcsé/.ett. Az SC 101 táptalaj összetétele magnézium szulfát ammóniumhidroxid szálas agar víz ad pH 5.2 ad 1000 ml 0,3 g 20,0 g A folyékony tenyészet morfológiája SB 203 táptalajon 6 napos inkubálás után: Világos drapp, aprópelyhes növekedés. Mikroszkópos vizsgálatban a tenyészet sejtjei 4-5 M vastag, erősen fénytörő, szeptált, egyenes lefutású, ritkán elágazó hifák. Az idősebb sejtek duzzadtak, erősen szemcsézettek. Az SB 203 táptalaj összetétele szacharóz borostyánkősav nátrium klorid ammóniumnitrát káliumdihidrogénfoszfát magnézi um szül fát ammóniumhidroxid ad pH 5,2 víz ad 1000 ml 100.0 g 10.0 g 20,0 g 3.0 g 0,5 g 0.25 g A törzs növekedése és alkaloidtermelése SB 203 táptalajon micélium szárazanyag alkaloid tartalom fajlagos alkaloid tartalom g/100 ml 35 0 1 2 3 4 40 5 6 0,3 0.7 1,22 i 68 2,18 ^,bb 2,82 gamma/ml 0 60 105 220 448 834 858 mg^y_ 0 86 8,6 13.0 20,6 31.5 30,4 Ammóniumnitrál halasa a toi/s alkaloidtermele amtnoniuniniti ar adagolás glUtei 0 2,0 3.0 6,0 10,0 15,0 alkaloid tartalom peptid típusú gamma/ml 17 napon) alkaloid hányad % í 7 napon) 1072 1482 1530 1121 1036 981 52 66 71 69 61 64 Szerves nitrogén adalék hatása a torzs alkaloidtermelésére : adalék (3,0 g/liter) aszparagm pepton kazein kukoricalekvár ammóniumnitrát (kontroll) alkaloidtartalom gamma/ml (7 napon) 945 402 "30 595 I042 Az alkaloidmeghatározásokal klnroform-izopropanol 4 1 arányú elegvcvel toriénő exttakció után. az extrahált alkaloidot alumíniumoxid rétegen kroma-75 tografálva végeztük. Az egyes komponenseket leold
