164499. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 22 750 RP trombolitikus enzim előállítására

17 A táptalaj pH-ját 120 ml 10 n nátriumkarbonát oldattal 7,50-re állítjuk be. A közeget 122°-os vízgőz átbuborékoltatásával 40 percig sterilizáljuk. Mivel a vízgőz a sterilizálás folyamán kondenzál, lehűlés után a táptalaj tér- 5 fogata 120 liter és pH-ja 7,0 lesz. Ezt a táptalajt beoltjuk Erlenmeyer-lomfoikban készült 200 ml rázott Streptomyces venetus DS 24 288 tenyészettel, keverés és steril levegő átbuboré.koltatása közben 28 óra hosszat 26 C°-on inku- 10 báljuk, és az így kapott tenyészettel beoltjuk a termelő táptalajt. A termelő fermentálást a következő anyagokat tartalmazó 800 literes fermentorban vé- 15 gezzük: kukoricalekvár (50% száraz anyag) 8 kg szójababolaj 6 liter ammóniumszulfát 0,8 kg 20 kobaltklorid-hexahidrát 0,008 kg "sapvízzel 360 literre kiegészítve. Miután a pH-t 450 ml 10 n nátriumkarbonáttal 6,40-re állítottuk be, hozzáadunk 2 kg kai- 25 ciumkarbonsavat, és 122 C°-os vízgőz átbuborékoltatásával 40 percig sterilizálunk. Lehűlés után a táptalaj térfogata a sterilizálás alatt cseppfolyósodott vízgőz miatt 390 liter, ezt 400 literre egészítjük ki azáltal, hogy 4 kg glukózhidrátot 30 tartalmazó 10 liter steril vizes oldatot adunk hozzá. Ekkor a táptalaj pH-ja 6,60. Ezt a táptalajt beoltjuk a 170 literes fermentorban a fent leírt módon készült 40 liter tenyészettel, és 116 óra hosszat 26 C°-on inkubáljuk, 35 miközben percenként 260 fordulatú turbinakeverő vei keverjük, és óránként 35 m3

steril levegővel levegőztetjük. A táptalaj végső pHrja 6,80, és a fermentlé térfogata 380 liter. A fermentlé proteolitikus aktivitása 0,4 K.E./ml. 40 b) Extrahálás 360 liter fermentlét keverővel ellátott edénybe öntünk, 18 kg szűrést elősegítő anyagot 45 adunk hozzá, a keveréket szűrőprésbe tápláljuk, és a szűrőlepényt 100 liter vízzel mossuk. Így 400 liter 0,35 K.E./ml titerű szűredéket kapunk. Ezt csökkentett nyomáson 35°-on 30 literre bepároljuk; a koncentrátum titere 3,77 K.E./ml. 50 A koncentrátum pH-ját 450 ml 6 n sósavval 4,0-ra állítjuk be, majd 300 g szűrést elősegítő anyagot adunk hozzá, szűrünk, és a szűrőlepényt 2 liter vízzel mossuk. A szűredéket 4°-on hűtjük, és regenerált cellulóz membránon át 4°-os 55 áramló desztillált vízzel szemben 7 óra hosszat dializáljuk. A kapott 37 liter dializátumot 4°-on hűtve, keverés közben hozzáadunk —10°-ra hűtött 111 liter acetont, és az oldószer hozzáadása után a keverést még 10—15 percig foly- 60 tatjuk. A hatóanyag tartalmú csapadékot szűrőn elválasztjuk, hideg acetonnal mossuk, és 20 Torr nyomáson 24 óra hosszat körülbelül 30°-on szárítjuk. így 997 g terméket kapunk. Titere 97 K.E./g. 65 18 c) Tisztítás — 1. lépés A fent leírt módon előállított 97 K.E./g titerű 1915 g nyers terméket 40 liter desztillált vízben oldjuk. Az így készített oldathoz keverés közben lassan hozzáadunk 9,6 kg kristályos ammóniumszulfátot (ezzel a számított menynyiséggel elérjük a sóval való telítettség 38%-át). A só hozzáadása után további 20 percig folytatjuk a keverést, majd 1800 g-vel centrifugálunk, és a kapott csapadékot elválasztjuk. A felül úszó folyadékhoz keverés közben lassan hozzáadunk 5 kg kristályos ammóniumszulfátot (ezzel a mennyiséggel a sóval való telítettség 52%-át érjük el). A só hozzáadása után még 15 percig folytatjuk a keverést, majd 1 óra hosszat állni hagyjuk, és 1800 g-vel centrifugáljuk. Az összegyűjtött hatóanyagtartalmú csapadékot 1 liter desztillált vízben oldjuk, és a kapott oldatot regenerált cellulóz membránon át 24 óra hosszat 4°-on 40 liter desztillált vízzel szemben dializáljuk. A dializátumot liofilizálva 70 g terméket kapunk. Titere 1200 K.E./ lg. Az elektroforézises elemzés szerint ez a termék 13% hatóanyagot tartalmaz. d) Tisztítás — 2. lépés A fent leírt módon előállított 102 g 1200 K.E./ lg titerű terméket 4100 ml desztillált vízben oldjuk, és a pH-t 66 ml n nátriumkarbonátoldattal 8,0-ra állítjuk be. Ehhez az oldathoz keverés közben lassan hozzáadunk 1,25 kg polietilénglikol—1500-at. Ezután 15 percig állni hagyjuk, majd 15 percig 4°-on 12 000 g-vel cent. rifugáljuk. Az aktív csapadékot 700 ml desztillált vízben oldjuk, és a kapott 800 ml oldatot 4°-on hűtjük, majd keverés közben lassan hozzáadunk 4 liter —60°-ra hűtött izopropanolt. Az aktív csapadékot —10°-on 15 percig 3000 g-vel való centrifugálással elválasztjuk, majd 0,2 Torr nyomáson foszforpentoxid jelenlétében 20° körüli hőmérsékleten szárítjuk. Így 30,7 g 1600 K.E./g titerű terméket kapunk körülbelül 20% aktív anyag tartalommal. e) Tisztítás — 3. lépés A fent leírt módon előállított 10 g 1600 K.E./g titerű terméket 400 ml desztillált vízben oldjuk, és a pH-t 3 ml n nátriumkarbonát oldattal 8,0-ra állítjuk be. Ekkor az oldathoz keverés közben lassan hozzáadjuk 26,6 ml 6,9-diamino-2--etoxi-akridinlaktát 6%-os vizes oldatát. További 15 percig keverjük, 4°-on 1 óra hosszat állni hagyjuk, majd 4°-on 12 000 g-vel 10 percig centrifugáljuk. A kapott inaktív csapadékot eltávolítjuk. A felül úszó folyadékot 0,2 Torr nyomáson 25°-on 25 ml-re bepároljuk, 4°-on hűtjük, és keverés közben lassan hozzáadunk 250 ml —60°-ra hűtött izopropanolt. Az aktív csapadékot —10°-on 15 percig 12 000 gvel centrifugáljuk, majd 0,2 Torr nyomáson foszforpentoxid jelenlétében 20° körüli hőmér-9