164499. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 22 750 RP trombolitikus enzim előállítására
19 sékleten szárítjuk. így 4,7 g 2240 K.E./g titerű terméket kapunk. Az elektroforézises elemzés szerint 37% aktív anyagot tartalmaz. f) Tisztítás — 4. lépés A fent leírt módon előállított 2240 K.E./g titerű 200 mg terméket 3 ml 6,5 pH-jú 0,01 mól foszfátpufferben oldjuk, és 3 ml izopropanolt és 4 g kromatograf álásra használt cellulózport adunk hozzá. A kapott pépet egyenletes vastagságban cellulózzal töltött kromatografáló oszlop tetejére visszük. Az oszlop átmérője 3 cm, és egyenlő térfogatú izopropanol és 6,5 g pH-jú 0,01 mólos foszfátpuffer keverékében elkevert 80 g cellulózt tartalmaz '(39 cm magasságban). Foszfátpuffer és izopropanol keverékével eluálunk olyan módon, hogy a keverékben a puffer arányát fokozatosan 50%-ról 100%-ra növeljük (a fokozatosan változó összetételű eluáló folyadék összes térfogata 1,5 liter); az eluálás sebessége óránként 35 ml. Az eluátumot körülbelül 20 ml-es részletekben gyűjtjük, és optikai sűrűségét „Uvicord L.K.B." analizátorral 280 nm-nél folyamatosan mérjük. A kapott diagramon az első csúcs nagyon aszimmetrikus, majd ettől jól elkülönítve a puffer 78—92% közötti koncentrációjának megfelelő második szimmetrikus csúcs látható. Az elektroforézises elemzés azt mutatja, hogy csak ez a második csúcs felel meg az aktív anyagnak. Az ennek a második csúcsnak megfelelő frakciókat (53—70. frakciók, vagyis 415 ml) összesítjük; az alkoholt 2 Torr nyomáson eltávolítjuk, majd regenerált cellulóz membránon át 24 óra hosszat 4°-on 10 liter desztillált vízzel szemben dializáljuk, és végül liofilizáljuk. 43 mg 6400 KE./ lg titerű terméket kapunk. Az elektroforézises elemzés szerint 55% aktív anyagot tartalmaz. 2. példa: Az 1. példa d) szakasza szerint előállított 1600 K.E./g titerű 3 g terméket 40 ml 8,6 pH-jú (/u = 0,0375) barbitálpufferben oldjuk, és az oldatot regenerált cellulóz membránon át 48 óra hosszat 4°-on 10 liter ugyanilyen puffer oldattal dializáljuk. Ezután az oldatot 15 percig 4°ón 12 000 g sebességgel centrifugáljuk, majd preparatív elektroforézisre használt Porath L.K.B. oszlop tetejére visszük. Az oszlop töltete 8,6 pH-jú {ju = 0,075) harbitálpufferrel itatott 1,5 kg cellulóz, ez 66 cm magasságnak felel meg az oszlopban. A készülékre ekkor 500 volt feszültséget alkalmazunk (az anód fent legyen); az áramerősség 0,46 A; az oszlop belsejében a hőmérsékletet körülbelül 20°-on tartjuk azáltal, hogy a kettős fal között állandóan 4°-os hűtőfolyadékot áramoltatunk át. Az elektroforézis első órájától kezdve a színes szennyező anyagok az anód felé vándorolnak. A színezett puffert eltávolítjuk, és friss pufferrel pótoljuk. Ezt a műveletet annyiszor ismételjük meg, ahányszor szükséges; a pigmentek eltávolítása 20 6 órai elektroforézis után csaknem teljes. Ekkor a feszültséget 400 voltra csökkentjük (az áramerősség 0,32 A), és az oszlop aljáról óránként 250 ml sebességű ellenáramú eluálást indítunk 8 meg; az eluátumot 50 ml-es frakciókként gyűjtjük, és optikai sűrűségét „Uvicord L.K.B." analizátorral 280 nm-nél folyamatosan mérjük. 15 órai eluálás után a feszültséget 500 voltra növeljük {áramerősség 0,40 A), és az ellenáramú 1° eluálás sebességét óránként 125 ml-re fokozzuk. 10 óra eltelte után, vagyis a művelet megkezdése után 31 órával, az elektroforézist befejezzük, és felülről lefelé az oszlopot óránként 210 ml sebességgel barbitálpufferrel eluáljuk. A ka-15 pott diagramon az első csúcs (az elektroforézis 23. órájában) kicsi, ezután három tökéletlenül elválasztott nagy csúcs következik. Az elektroforézises elemzés azt mutatja, hogy csak a harmadik csúcs tartalmazza az aktív anyagot. 20 Az ennek a harmadik csúcsnak megfelelő frakciókat [(vagyis 1425 ml-t) összegyűjtjük, 2 Torr nyomáson 400 ml-re bepároljuk, majd 24 óra hosszat háromszor dializáljuk, mindannyiszor 50 liter 4°-os desztillált vízzel. A dializált oldatot 25 2 Torr nyomáson 10 ml-re bepároljuk, majd 4°on hűtve keverés közben lassan hozzáadunk 100 ml —60°-ra hűtött izopropanolt. Tíz percig —10°-on 12 000 g-vel centrifugálva a kicsapódott aktív anyagot elválasztjuk, majd 0,2 Torr 30 nyomáson foszforpentoxid jelenlétében körülbelül 20°-on megszárítjuk. így 276 mg 7000 K.E./g titerű terméket kapunk; ez az elektroforézises elemzés szerint 35 65% aktív anyagot tartalmaz. A termék szén, hidrogén, oxigén, nitrogén, foszfor és kén elemeket tartalmaz. Elemi összetétele: 44,0% szén, 6,5% hidrogén, 12,5% nitrogén, 0,35%. foszfor és 0,65% kén. 40 10 g anyag savas hidrolízisterméke a következő aminosavakat tartalmazza: 8,5 mmól aszparaginsav, 7 mmól treonin, 6,5 mmól szerin, 5 mmól glutaminsav, 2 mmól prolin, 10,5 mmól glicin, 7,5 mmól alanin, 5,5 mmól valin, 2 mmól 45 izoleucin, 3 mmól leucin, 3,5 mmól tirozin, 1 mmól fenilalanin, 2 mmól lizin, 2 mmól arginin és 1,5 mmól hisztidin. Fizikai tulajdonságai a következők: Külső megjelenése: barnássárga por (liofilizá-50 lás után). Ultraibolya spektruma (0,02%-os vizes oldatban meghatározva): abszorpció 210 nm-nél Efcm =205; abszporciós minimum 250 nm-nél E^m = = 7,8; abszorpciós maximum 278 nm-nél Eiem = = 14,1. 60 Infravörös spektruma {sajtolt KBr-os keverékben meghatározva): A spektrum a 2. ábrán látható, az abszciszszára a mikronokban kifejezett hullámhossza-65 kat (felső skála), illetve a cm-1 -ben kifejezett 10
