164499. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 22 750 RP trombolitikus enzim előállítására

164499 15 (.4. táblázat folytatása) 16 SzénHasz-NitrogénHaszforrás nosítás forrás nosítás maltóz + DL-alanin + szacharóz + DL-valin + trehalóz + DL-aszparaginsav + cellobióz + L-glutaminsav + raffinóz + L-arginin + dextrin + L-lizin + inulin — DL-szerin + amidőn + DL-treonin + glikogén + taurin — glicerin + DL-fenilalanin + eritrit — L-tirozin + adonit + DL-prolin + dulcit — L-hidroxiprolin + D-mannit + L-hisztidin + D-szorbit — L-triptofán + inozit + bétán + szalicin -4-de lassú Az előállítás a következő lépésekből áll: Streptomyces venetus DS 24 288 törzs tenyésztés agáron tenyésztés rázott lombikban inokulum előállítása fermentorban termelés fermentáló készülékben A fermentáló közegnek asszimilálható szénforrást és asszimilálható nitrogénforrást, szervetlen anyagokat és adott esetben növekedést elősegítő és sűrítő anyagokat kell tartalmaznia, ezeket az alkotórészeket jól definiált termékek vagy bonyolult összetételű biológiai eredetű anyagok alakjában adhatjuk hozzá. Asszimilálható szénforrásként szénhidrátok, például glukóz, szacharóz, laktóz, dextrinek, keményítő, melasz vagy más szénhidrátszerű anyagok, például többértékű alkoholok, mint a glicerin vagy mannit vagy bizonyos szerves savak, például tejsav, citromsav, borkősav használhatók. Egyes állati vagy növényi eredetű olajok, mint a disznózsírból préselt olaj vagy a szójababolaj, előnyösen helyettesíthetik ezeket a szénhidrátokat vagy ezekkel együtt használhatók. Az alkalmas asszimilálható nitrogénforrások rendkívül változatosak lehetnek. Lehetnek nagyon egyszerű vegyületek, például nitrátok, szervetlen vagy szerves ammóniumsók, karbamid, aminosavak. Bonyolult összetételű, a nitrogént főleg fehérje alakban tartalmazó anyagok, például kazein, laktalbumin, glutin és hidrolizátumaik, szójabab-, földimogyoró-, halliszt, húskivonat, élesztőkivonat, kukoricalekvár, szeszmoslék is használhatók. A hozzáadott szervetlen anyagok közül egyesek pufferoló vagy közömbösítő hatásúak, ilyenek az alkáli- és alkáliföldfémfoszfátok vagy a kalcium- és magnéziumkarbonátok. Más vegyületek, például az alkálifémek és alkáliföldfémek kloridjai és szulfátjai a Streptomyces venetus DS 24 288 fejlődésére és a 22 750 RP enzim termelésére szükséges ion-5 egyensúlyt biztosítják. Végül a vas és kobalt sói a Streptomyces venetus DS 24 288 anyagcsere-reakcióinak speciális aktivátoraiként működnek. A sűrítők közül leggyakrabban keményítőt, 10 karboximetilcellulózt és agart használunk. A fermentlé pH-jának kezdetben 6,0 és 7,8 között, előnyösen 6,4 és 7,5 között kell lenni. A fermentálás optimális hőmérséklete 25—28 C°, de kielégítő kitermelés érhető el 23 és 40 C° 15 között is. A fermentálásban a levegőztetés elég tág határok között változtatható, de azt tapasztaltuk, hogy fermentlé-li terenként és peroenként 0,3—2 liter levegő különösen előnyös. A 22 750 RP enzim legnagyobb kitermelését a 20 használt táptalajtól függően 1—7 napi tenyésztés után érjük el. A fermentléből a 22 750 RP enzimet a proteinek elválasztására és frakcionálására használatos módszerek szerint extrahálhatjuk és 25 tisztíthatjuk, és a termék hatásosságát és tisztaságát alkalmas eljárásokkal, például kazeinnel való aktivitás-meghatározással és elektroforézissel ellenőrizhetjük. 30 A fermentléből a 22 750 RP enzimet úgy különíthetjük el, hogy szűrést elősegítő anyag jelenlétében szűrőre visszük, szűrjük, .a szűredéket áramló desztillált vízzel dializáljuk, és a dializátumból acetonnal kicsapjuk a 22 750 RP 35 enzimet. Az így kapott nyers 22 750 RP enzimet a szokásos fizikai-kémiai módszerekkel tisztíthatjuk. A tisztítás abból áll, hogy az enzimet desztillált vízben oldjuk, majd ismét kicsapjuk 40 olyan vegyületek tömény vizes oldataival, amelyekben az enzim csak nagyon kevéssé oldódik; ilyen vegyületek a semleges sók. A 22 750 RP enzimet különféle hordozókon, például alumíniumoxidon, oellulózporon, dex-45 trán- vagy poliakrilamid-ngélen való kromatografálással vagy dialízissel, illetőleg preparatív elektroforézissel is tisztíthatjuk. A következő példák a találmány gyakorlati végrehajtását szemléltetik korlátozás szándéka 50 nélkül. A hőmérsékleti adatokat Celsius-fokban adjuk meg. 1. példa: 55 a) Fermentálás Egy 170 literes fermentorba betöltjük a következő anyagokat: 60 65 pepton húskivonat glukózhidrát szójababolaj nátriumklorid csapvízzel kiegészítve 600 g 600 g 1200 g 120 ml 600 g 110 literre 8