164498. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükoprotein előállítására
164498 13 14 0,12 ng termék rendelkezik egységnyi hisztaminopexiás hatással. Ha a kapott frakció aktivitását összehasonlítjuk az előző elválasztási lépésben elkülönített frakcióéval, megállapíthatjuk, hogy a kromatográfiás módszerrel 25-szörös dúsítás érhető el; X'jug 1/X' mg Kiindulási szérum 1,67 598 Dialízissel kapott frakció 3X10-3 0,33 X10 6 Kromatografalással kapott frakció 0,12X10-3 8,30X10 6 A kiindulási szérumra vonatkoztatott dúsítás mértéke tehát 13 OOO-szeres. Sertés antiszérum immunosizérummal szemben végzett immunoelektroforézis során két, különböző elektroforetikus mozgékonysággal rendelkező gyűrű (azaz egy ^i-globulin-szerű és egy prealbumin-szerű elektroforetikus mozgékonysággal rendelkező gyűrű) jelenik meg. Értékelési Ismeretes, hogy a karboximetilcellulóz kationcserélő gyanta. A 4,2-vel kezdődő pH-tartományban a legtöbb fehérje kationként viselkedik, azaz megkötődik az ioncserélőn. A vizsgált szérum-komponens — amelynek izoelektromos pontja pH = 4,0 + 0,1 érték — a fenti körülmények között negatív töltést vesz fel és nem kö tődik meg az ioncserélőn. A fenti ioncserés kromatográfia körülményei között annak a tényezőnek is jelentősége van, hogy milyen az ioncserélő affinitása a különböző kationokhoz fehérje és Na+ jelenlétében. Tekintettel arra, hogy a kationcserélő Na+ -affinit;ása nagyobb az egyéb affinitásí-értéke'knél, 0,1 mólos pufferoldat alkalmazásával is megakadályozhatjuk az aktív frakció részleges megkötődését az oszlopon — így a hozamot fokozhatjuk — anélkül, hogy a pH = =4,2-nél nagyobb izoelektromos ponttal rendelkező fehérje-kamponensek megkötődését befolyásolnánk. Következtetések;: A karboximetilcellulózon végzett kromatografálás eredményei megerősítik az elektromos konoentrálás során észlelt eredményeket, nevezetesen azt, hogy a hatóanyag igen alacsony (4,0) izo-elektromos ponttal rendelkezik. iKarboximetilcellulózon végzett kramatografálás B) Emberi szérum Kísérleti módszer: A sertésszérum kromatografálásánál ismertetett módon járunk el. A kísérlethez 500 mg, liofilizált emberi plazmából dialízissel elkülönített anyagot használunk fel. Eredmények: A hisztamin izolált tengerimalac-ileumra gyakorolt biológiai hatásának csökkentésére csak az a frakció alkalmas, amely az ioncserélőn pH = = 4,2 értéken meg nem kötött anyagot tartalmazzia. A hisztaminopexiás aktivitás meghatározása A fehérjefrakció hisztamin-megkötő képességét a hisztamin izolált tengerimalac-ileumra kifejtett izommerevítő hatásának mérésével határozzuk meg. A szérumot vagy a szérumfehérje-frakciót tiród-folyadékban oldjuk. A vizsgálandó szervet milliliterenként 30 jug szérumfrakciót tartalmazó oldattal hozzuk érintkezésbe. Hatóanyagban dús frakciók, illetve tiszta hatóanyag-frakciók felhasználása esetén sorozathígításos kísérleteket végzünk. Az eredményeket diagramon tüntetjük fel. A diagram abszcisszáján a koncentráció reciprokat tüntetjük fel logaritmikus léptékben, míg az ordinátán a minta által megkötött hisztamin százalékos mennyiségét vesszük fel. Azt találtuk, 'hogy a maximális aktivitás egy szakaszon állandó érték, majd csökken, végül — a vizsgált frakciótól függő érték — nullát ér el. A hisztaminmegkötő képesség szisztematikus meghatározását a görbe állandó szakaszán — azaz a maximális aktivitású tartományban — végezzük. íSoroZathígításos kísérletekkel megállapítottuk, hogy a görbe állandó szakasza az egy hisztaminopexiás egységnek megfelelő X koncentrációig terjed. Ezután a görbe lineárisan csökken, majd egy adott koncentráció-küszöbnél 0 értéket vész fel. A fentiekben a hisztaminmegkötő képességet pontosan meghatározott kísérleti körülmények között megkötött hisztamin százalékos mennyiségével fejeztük ki. Egészséges egyének vérszéruma — a farmakológiai vizsgálatok szerint •— ml-ként átlagosan 4000 hisztaminopexiás egységnek megfelelő aktivitást mutat. 2 ng tiszta frakció hisztaminopexiás aktivitása 1 egységnek felel meg, azaz a tiszta frakció hisztaminopexiás aktivitása 500 000 egység/mg. A következőkben a hisztaminopexiás hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények összetételét ismertetjük. Krém Glükoprotein (az 1. példában leírt eljárással kapott termék) 2 g Emulcire 12 M (a Societé Gattefossé cég által előállított emulgeálható ketosztearilalkohol) 10 g Labrafac 1394 (a Societé Gattefossé cég által előállított telített folyékony triglicerid-elegy) 20 g Vazelin 10 g Metil-P-hidroxi-benzoát 0,135 g Propil-p-hidroxi-benzoát 0,015 g Polysorbate 80 0,06 g Víz q. s. ad 100 g 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
