164431. lajstromszámú szabadalom • Eljárás noretiszteron származékok előállítására mikrobiológiai úton
7 razanyagot tartalmazó, 500 ml-es Erlenmeyerlombikban sterilezett táptalajt. A beoltott lombikot -37 C°^QS termosztát-szobában rázatva inkubáljuk 1 napon át. Az egynapos tenyészet 5 ml-ével ugyancsak 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett, 100 ml alábbi összetételű táptalajt oltunk: 0,1% aszparagin, 0,1% kukoricalekvár szárazanyag-tartalom, 0,4% élesztőkivonat szárazanyag-tartalom, 0,1% KH2 P0 4 , 0,5% glükóz, 1,0% „nyomelem-oldat", pH sterilezés előtt 6,5—7,0 értékek közé állítva. A táptalajhoz használt „nyomelem-oldat" öszszetétele: 1 g CaCl2 , 10 mg Co(N03 ) 2 -6 H 2 0, 88 mg ZnS04 -7 H 2 0, 3,9 mg CuS04 -5 H 2 0, 1,0 mg NiSCv 7H2 0, 0,8 mg Na2 B 4 O 7 -10 H 2 0, 0,72 mg MnCl2 -4 H 2 0, 0,37 mg i(NH4 ) 6 NoyO^-á H 2 0, 1,0 mg FeS04 -7 H 2 0. 1 literre desztillált vízzel feltöltve. A beoltott táptalajt tartalmazó lombikot 37 C°-os termosztát-szobában 1 napon át rázatjuk. Ezután a tenyészethez 10 mg hidrokortizont adunk, és még 2 órán át folytatjuk az inkubálást. Az így nyert indukált tenyészetet steril vízzel tízszeresére hígítjuk, és 10 db 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba osztjuk szét, majd lombikonként 40 mg 10/2,17/J-dihidroxi-l 7«-etinil-ö,sztr-4-én-3-ont adagolunk 2 ml 0,2 g kalciumkloridot tartalmazó metanolban oldva. Az adagolás után a tenyészetet 37 C°-os termosztát^szobában 1 napon át rázatjuk. Ezután a fermentlét 3XV4 térfogat etilacetáttal extraháljuk és az egyesített extraktumot vákuumban .bepároljuk. A maradékot preparatív vékonyrétegkromatográfiával tisztítjuk 1 ;mm vastagságú szilikagél-rétegen 70% etilacetátot és 30%, heptánt tartalmazó futtató rendszert alkalmazva, hogy a terméket az átalakítás során kis menynyiségben visszamaradó 10i/J,17jő-dihidroxi-17ia-etinil-ösztr-4-én-3-ontól elválasszuk. A vékonyrétegkromatográfiásan tisztított terméket acetonból átkristályosítva 185 mg 10^,17^-dihidroxi-17ia-etinil-ösztra-l,4-dién-3-iont nyerünk; op. 265—267 C°; [a]D = — 79° (c=l, metanol); lmax : 241 m/t i(e == 12 050). Elemzési eredmény a C2 oH 24 03 képletre (M = ^ 312,41) vonatkoztatva: számított: C 76,89% H 7,74%; talált: C 76,92% H 7,70%. Infravörös színkép i(KBr): »OH 3100—3600 (max. 3380) cm"1, v( CH) 3250 cm"1 , rC=0 8 1665 cm-1 (3-as keton), »<C=C 1615 és 1605 cm" 1 (Jl-es és zl4-es kettős kötés). Mágneses magrezonancia spektrum (DNSO-d4 ): c3CH3 .(18-as) = 0,83 ppm, ő( = CH) = 3,25 5 (etinilcsoport). Az l-es, 2-es és 4-es .szénatomokon levő hidrogének AMX spektrumot adnak: JAM= 10, JMX=2, JAX AÍ 0 Hz, őx = 5,95, <5M = = 6,1 ÖA = 7,2 ppm. Molekulasúly a tömegspektrum alapján 312. 10 6. példa: Fusarium lateritium (MNG 81) egyhetes burgonyás ferdeagaron nőtt tenyészetéből 10 ml 15 steril vízzel szuszpenziót készítünk, és ebből 1—1 ml-rel 3 db 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100—100 ml 2% glükózt és 2% földimogyorólisztet tartalmazó táptalajt oltunk. A beoltott lombikokat 24 C°-os termosztát-20 szobában rázatva inkubáltuk 2 napig, majd 10 l-es üvegfermentorban sterilezett 5 1 alábbi összetételű táptalajra oltottuk: 1,5% kukoricalekvár, 23 1 %, glükóz, 1,5% szójaliszt, pH sterilezés előtt 6,8 értékre állítva. A tenyészetet 300/perc fordulatszámmal kevertetjük 5 l/perc levegő átáramoltatása mellett 24 C°-os vízfürdőben. Egy nap múlva 1 g 17/3-_hidroxi-17ia-etinil-ösztr-4-én-3-ont adagolunk a tenyészethez 40 ml dimetilformamidban oldva. Három nappal később a fermentlét leszűrjük, a szűr letet 3XV4 térfogat etilacetáttal extraháljuk. Az egyesített extraktumot vákuumban bepároljuk. A kapott nyers terméket preparatív rétegkromatográfiával tisztítjuk 1 mm mastag szilikagél rétegen 70%, etilacetátot és 30% heptánt tartalmazó futtatószert alkalmazva. Így 380 mg 6y3,17;/?-dihidroxi-17a-etinil-ö;Sztr-4-én-3--onhoz jutunk; op. 193—196 C°; [a]D = —123° (c=l, metanol); kmax : 237 m// (e = 13 900). 45 Elemzési eredmény a C 2oH 2 ß0 3 képletre (M = = 314,43) vonatkoztatva: számított: C 76,40% H 8,34%; talált: C 76,55% H 8,29%. 50 Infravörös színkép {KBr): )--OH 3100—3600 (max. 3385) cm -1, v£=0 1655 cm"1 (3-as keton), «C=C 1618 an -1 (zl-e,s kettős kötés). Mágneses magrezonancia spektrum: (DMSO-55 -d6 ): áCH 3 i(18-as) =0,83 ppm, ő( = CH) = 3,25 ppm (17-es etinilcsoport), ŐCH i(6-os) = 4,25 ppm, (5CH (4-es, olefin) = 5,8. Molekulasúly a tömegspektrum alapján: 314. 60 7. példa: Cephaloisporium asperum (MNG 82) egyhetes burgonyás ferdeagaron nőtt tenyészetéből 10 mi steril vízzel szuszpenziót készítünk, melynek 65 1—1 ml-ével 3 db 500 ml-es Erlenmeyer-lombik-4
