164371. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein, valamint a kallikrein A és B komponenseinek tisztítására és kristályosítására

164371 10 1. példa: a) A 910 580 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban ismertetett módon sertés hasnyálmirigyéből kapott, ólomsó kicsiapás útján előállított csapadék dializáit eluátumából indulunk ki. (Az eluátumot például a fenti szabadalmi leírás 2. példája szerint úgy állítjuk elő, hogy 90 liter hasnyálmirigy-autolizátumhoz keverés közben 12,6 liter 10%-os ólom^acetát-oldatot adunk, a kapott csapadékról az anyalúgot leszívatjuk, majd a csapadékot 5 liter vízzel mossuk, és a vízből a csapadékot kiszűrjük. Ezután a kapott csapadékot 3 liter desztillált vízzel felkeverjük, és a vizes szuszpenzióhoz keverés közben 2,5 liter 16%-os diammónium-hidrogén-foszfát-oldatot adunk, majd egy órás keverés után a keveréket centrifugáljuk, és az így kapott tiszta oldatot 72 órán át folyóvízzel szemben dializáljuk. 200 liter, 10,8 millió KE egységnyi hatóanyagot tartalmazó részt vékonyfimibepárlóban 15 literre betöményítünk, majd Sephadex G—25 -márkanevű anyagból készült oszlopon gélszűrés útján sótalanítunk. A sótalanított oldat pH értékét ecetsavval pH 5,0-ra beállítjuk, és az ekkor képződő kis mennyiségű csapadékot szűrés útján elkülönítjük. Ezt követően szilárd ammónium-acetátot adagolunk, míg a fajlagos vezetőképesség eléri a 12 mS értéket. Az így kapott oldatot felvisszük egy 20X65 cm (120 literes) nagyságú, DEAE-Sephadex A—50 márkanevű anyaggal töltött oszlopra, melyet előzőleg 5,0 pH értékű 0,2 mólos ammónium^aoetát oldattal átöblítettünk, amikoris a kallikrein adszorbeálódik. Az oszlopot ezt követően először mintegy 40 liter 5,0 pH értékű 0,25 mólos ammónium-acetáttal, majd 4,5 pH értékű 0,3 mólos ammónium-acetáttal eluáljuk. A kallikrein az eluátumban közvetlenül azután jelenik meg, amikor a pH érték mintegy 4,5-re süllyed (lásd 3. ábrát). Az aktív frakciók 9,35 millió KE aktivitású hatóanyagot tartalmaznak (86,5%). Az oldatot vákuumban betöményítjük, és Sephadex G—25 márkanevű anyaggal töltött oszlopon sótalanítjuk. A kapott oldatból vett minta liofilizálás után 414 KE/mg bemérés fajlagos aktivitású. Magyarázat a 3. ábrához Ordinátaegységek: 0—800: kallikrein-egységek (KE) pro ml oldat; 100—20: ultraibolya-transzmisszió százalékokban hullámhossz 280 nm); 4,2—5,0: pH értékek; Abszcisszaegység: frakciószám. A folyamatos görbe az ötös és a negyvenötös frakció között bemutatja az ultraibolya spektroszkópiai abszorpció lefutását az eluálás folyamán, míg a szaggatott görbe a pH érték változását mutatja be. A háromszögeket összekötő vonal az eluálás során az aktivitás változását hivatott bemutatni (egységek KE/ml-ben). b) A 300 ml térfogatú sótalanított oldatot 10X130 cm méretű (10 literes), CM-Sephadex C—50 márkanevű anyaggal töltött oszlopon, melyet előzőleg 5,0 pH értékű 0,01 mólos ammánium-aoetáttal átöblítettünk, szűrjük. Az elu-5 átumban először a kallikrein jelenik meg, ezt követően az inaktív szennyeződések (lásd a 4. ábrát). A kallikrein-frakció (930 ml) 5,5 millió KE (59%) aktivitású hatóanyagot tartalmaz. A frakcióból vett liofilizált minta fajlagos akti-10 vitása 1060 KE/mg bemérés, illetve 1220 KE/mg fehérje. A lázkeltő hatás a Deutsches Arzneimittelbureau által meghatározott módon mérve 1,85 értékű [3 állatra vonatkoztatva 2 (T)2]. 15 Magyarázat a 4. ábrához Ordinátaegysége: 0—800: KE/ml oldat; 100—20: Ultraibolya-transzmisszió százalékokban 20 (hullámhossz 280 nm); Abszcisszaegység: frakciószám. A háromszögeket összekötő vonal az eluátumban az .aktivitás lefutását mutatja, KE/ml-ben megadva. A másik görbe az ultraibolya-abszorp-25 ció lefutását mutatja. c) Kristályos kallikrein előállítása Az oldat 115 000 KE egységet tartalmazó ré-30 szét 5 ml-re betöményítjük, és telített ammónium^szulfát-oldattal 45%,-ban telítettre beállítjuk. '6 nap alatt 20—25 C°-on a kikristályosodás végbemegy. 3 hét után a kristályokról az anyalúgot lecentrifugáljuk, először 5 ml 50%-ban 35 telített ammónium-szulfát-oldattal mossuk, majd pH 7,0 értékű 0,05 mólos foszfátpufferben feloldjuk. A kallikrein fajlagos aktivitása ebben az oldatban 1560 KE/mg fehérje. A termelési hányad 71%, a lázkeltő hatás a Deutsches Arznei-40 bureau által megadott módon mérve 0,32. d) Kristályos kallikrein B komponens előállítása Nagytisztaságú, a b) részben ismertetett mó-45 don előállított kallikrein 4,42 millió KE egységet tartalmazó oldatát 5X100 cm méretű, DEAESephadex A—50 márkanevű anyaggal töltött oszlopon, melyet előzetesen 6,7 pH értékű 0,2 mólos ammónium^acetáttal öblítettünk át, ad-50 szorbeáltatjuk. Az eluálást pH 6,7 értékű 0,2— 0,55 mólos ammónium^acetát konvex gradiensben történő felhasználásával végezzük. Az ammónium^acetátot 2 literes keverőedényben állítjuk elő. Az eluátumban a kallikrein két, enyhén átfedett aktivitáscsúcsa jelenik meg, melyek közül az első a kallikrein B komponens, míg a második a kallikrein A komponens az elektroforetikus vizsgálat tanúsága szerint. A tiszta kallikrein A komponenst, illetve B komponenst tartalmazó frakciókat egyesítjük. A korábbi mérés alapján az alábbi termelési hányadok állapíthatók meg: 2,1 millió KE egységnyi kallikrein B komponens (47,5%), 1,25 millió KE egységnyi kallikrein A komponens (28%) és a csú-65 csók átfedési területéből származó A—B kom-55 60 5