164156. lajstromszámú szabadalom • Eljárás YA-56 antibiotikum előállítására

7 164156 8 Meg kell jegyeznünk, hogy a Streptomyces sp. MCRL 0387 légmicéliumainak higroszkópos jellege megszűnhet, ha a törzset több generáción át sorozatban tenyésztjük, a higroszkópos jelleg azonban a talajmintából elkülönített eredeti törzs tenyésztésekor világosan észlelhető. Megjegyezzük azt is, hogy a Streptomyces sp. MCRL 0387 vagy Streptomyces sp. MCRL 0432 törzsek természetes vagy mesterséges mutánsai vagy variánsai Az YA 56 antibiotikum legnagyobb részt a fermentlé folyadékbázisában gyűlik össze. Ennek megfelelően a mikroorganizmusok növekedési fázisa után a micéliumokat A találmány oltalmi körét nem korlátozzuk a Streptomyces sp. MCRL 0387 és Streptomyces sp. MCRL 0432 törzs felhasználására. A találmány oltalmi köre a fenti két törzs természetes vagy mesterséges mutánsainak vagy variánsainak alkalmazására is kiterjed. Hangsúlyozzuk, hogy a leírásban és az igénypontokban az „YA 56 antibiotikumot termelő Streptomyces humidus törzs" megjelölésen a Streptomyces sp. MCRL 0387 vagy Streptomyces sp. MCRL 0432 valamennyi olyan természetes vagy mesterséges mutánsát vagy variánsát is értjük, amely YA 56 antibiotikumot termel. Az YA 56 jelű új antibiotikumot a találmány szerint úgy állítjuk elő, hogy valamely YA 56 antibiotikumot termelő Streptomyces humidus törzset, így Streptomyces sp. MCRL 0387-t, Streptomyces sp. MCRL 0432-t vagy azok mutánsait vagy variánsait aerob körülmények között vizes táptalajon tenyésztjük, és az antibiotikumot elkülönítjük a fermentléből. A fermentációt aerob körülmények között rázott vagy szubmerz tenyészetben egyaránt végrehajthatjuk. Táptalaj-komponensekként az Actinomyceták tenyésztésében általánosan felhasználható tápanyag-forrásokat alkalmazhatjuk. Ennek megfelelően nitrogénforrásként pl. peptont, húskivonatot, porított földimogyorót, fehérjehidrolizátumokat, szervetlen nitrátokat, illetve ammóniumszulfátot, szénforrásként pl. glükózt, laktózt, maltózt, keményítőt, glicerint és szójaolajat, szervetlen anyag-forrásként pedig pl. nátriumkloridot, foszfátokat, szulfátokat és kalciumkarbonátot használhatunk fel. A táptalajhoz kismennyiségű ként és/vagy nehézfémiont, pl. réziont is adhatunk. A rézion jelenléte nagymértékben növeli az YA 56 antibiotikum hozamát. Ha a tenyésztést szubmerz körülmények között végezzük, a tenyésztési közeghez kívánt esetben habzásgátló anyagot, pl. szilikonolajat, növényi olajokat, ásványi olajokat vagy felületaktív anyagokat adhatunk. A fermentációt előnyösen közel semleges pH-értéken, 25—35 C°-on, célszerűen 27—30C°-on hajtjuk végre. A fermentáció során a fermentlé antibiotikum-koncentrációját igen könnyen meghatározhatjuk úgy, hogy a fermentlé mintáját korong-módszerrel Bacillus subtilis vagy Escherichia coli vizsgálati mikroorganizmus felhasználásával vizsgáljuk. A maximális YA 56 antibiotikum-hozamot rendszerint a tenyésztés ötödiknyolcadik napján érjük el. Az YA 56 antibiotikum legnagyobb részt a fermentlé folyadékfázisában gyűlik össze. Ennek megfelelően a mikroorganizmusok növekedési fázisa után a micéliumokat és az egyéb szilárd 5 komponenseket szűréssel vagy centrifugálással eltávolítjuk a fermentlébtől. A szűrést kívánt esetben diatómaföld szűrési segédanyag jelenlétében végezhetjük. A szűrletet, vagy a felső folyadékréteget megfelelő adszorbensen, pl. aktív szénen 10 vagy bentoniton adszorbeáljuk, vagy gyenge kationcserélő gyantával [pl. metakrilsav-divmilbenzol kopolimerrel (Amberlite IRC-50, a Rohm Haas Co. Ltd. cég gyártmánya)], nem-ionos gyantával [pl. porózus mátrix-gyantával (Duolite S-30, a 15 Diamond Shamrock Chemical Company cég gyártmánya] vagy metakrilát-divinilbenzol kopolimerrel (High porous polymer HP-20, a Mitsubishi Chemical Industries Ltd. cég gyártmánya) töltött oszlopon bocsátjuk át. Ezután az abszorbenst 20 vagy az oszlopot megfelelő oldószerrel eluáljuk. Ha adszorbensként aktív szenet, bentonitot vagy porózus mátrix-gyantát alkalmazunk, eluálószerként 0,1 n vizes sósavoldat és metanol elegyét (pH = 1,2) használhatjuk. Ha az antibiotikumot 25 metakrilsav-divinilbenzol kopolimeren abszorbeáltatjuk, eluálószerként gyengén lúgos oldatokat, pl. 10%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldatot vagy 10%-os vizes nátriumhidrokarbonát-oldatot, illetve savas oldatokat, pl. vizes sósavoldatot 30 (pH = 2,0) vagy 0,1 n vizes sósavoldat és aceton elegyét (pH = 1,2) használhatjuk. A kapott eluátum pH-ját ezután lúgosra vagy semlegesre állítjuk, majd, az eluátumot csökkentett nyomáson bepároljuk, és a kapott koncentrátumot fagyasztva 35 szárítjuk. Nyers YA 56 antibiotikum-port kapunk. Az YA 56 antibiotikumot úgy is elkülönítjük, hogy a betöményített oldathoz metanolt adunk, az oldhatatlan anyagokat eltávolítjuk, majd az oldatot acetonnal elegyítjük. Az utóbbi művelet-40 ben nyers antibiotikum-por válik ki. A nyers antibiotikumot alumíniumoxidon végrehajtott kromatografálással tisztíthatjuk. Eljárhatunk úgy is, hogy a nyers antibiotikum oldatához megfelelő oldószert adunk. Egy további eljárás-45 változat szerint a nyers antibiotikumot gélszűréssel tisztítjuk, szűrőanyagként nem-ionos keresztkötéses poliszacharidokat, pl. keresztkötéses dextrángélt (Sephadex G-l 5, a Pharmacia Fine Chemical Co. cég terméke) vagy alkilezett keresztkötéses dext-50 rangéit (Sephadex LH-20, a Pharmacia Fine Chemical Co. cég terméke) alkalmazunk. Ha a találmány szerinti fermentációt rézionok jelenlétében hajtjuk végre, az YA 56 antibiotikumot rézzel alkotott kelátja formájában is elkülönítjük. 55 Az YA 56 antibiotikum kelátjából vegyszeres kezeléssel, pl. hidrogénszulfid felhasználásával könnyen eltávolíthatjuk a rézionokat. A találmány szerint előállított YA 56 antibiotikum lényegében két komponensből áll, amelye-60 ket YA 56-X és YA 56-Y jelöléssel különböztetünk meg egymástól. A két komponens pl. kromatográfiás úton különíthető el egymástól. Azt tapasztaltuk, hogy ha az YA 56 antibiotikumot hidrokloridja vagy a szabad bázis formájában 65 papirkromatográfiának vetjük alá és eluálószerként 4