163865. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikumok előállítására

11 163865 12 /. példa Az A-201-es antibiotikum termelése rázott tenyészetben A Streptomyces capriolus NRRL 3817 spóráit az alábbi összetételű szilárd ferde agar táptalajra oltjuk le: vező, alábbi összetételű táptalaj, (a továbbiakban inokulum táptalaj) beoltására. Elesztőkivonatos agar Mennyiség 5g 10g 20 g 1 liter Alkotó glükóz Élesztőkivonat Agar Desztillált víz A ferde táptalajokat az NRRL 38I 7 spóráival oltjuk le és 6 napon át 30 C° hőmérsékleten inkubáljuk. Az érett ferde tenyészeteket ezután steril desztillált vízzel fedjük es a spook fellazítása céljából steril kaccsal megkaparjuk. Az így kapott spóra szuszpenziót erőteljesen keverve egyenletes eloszlást hozunk létre és a szuszpenzió 1 cm3-nyi mennyiségével 100 cm3 alábbi összetételű táptalajt oldtunk be, amely kedvez a vegetatív növekedésnek. Táptalaj a vegetatív inokulum tenyészetére Alkotó Dextróz Szójaliszt Kukoricalekvár CaCo3 NaCI Csapvíz Mennyiség 15g 15g 5g 2g 5g 1 liter A vegetatív növekedést biztosító táptalajt a beoltás előti autoklávban 30 percig 120 C°-on sterilezzük A beoltott, a vegetatfv növekedést biztosító táptalajt 250 ford/perc sebességű sík rázogepen tolyaniatos razas kozbci, 30 C°-on 48 órán át tenyésztjük. Az előbbivel megegyező összetételű táptalajból 0,01 cm -es adagokat 500 cm3 Erlenmeyer lombikokba viszünk és azokban 30 percig 120 C-on sterilezünk. A táptalaj lehűlése után a lombikokat a megelőző szakaszban leírt módon inkubált vegetatív inokulum 5-5 cm3-es adagjaival oltjuk be. A termelésre szolgáló tenyészetet 25ü lord/perc sebességű sík rázógépen 30 C-on 72 órán át rázzuk. A be nem oltott táptalaj pH-ja közelítőleg 7,0. A pH értéke a fermentáció ideje alatt fokozatosan növekszik és a fermentáció végén kb. 7,5. Az antibiotikus hatású anyagot a fermentációs közegből a szakmában jól ismert módszerekkel nyerjük ki. 2. példa A. Az A-201-es antibiotikumok termelése 1 125 literes fer mentorban A Streptomyces capreolus NRRL 3817 spóráit az alábbi összetételű ferde agar táptalajra oldjuk le: Alkotó Glükóz Élesztőkivonat Agar Desztillált víz Mennyiség 5g 10g 20 g 1 liter A beoltott ferde táptalajt 30 C körüli hőmérsékleten kb. 5 napig inkubáljuk, majd kis mennyiségű steril desztillált vizet adunk és az agar felületét a mikroorganizmusok fellazítására és vizes szuszpenzió előállításának céljából steril platina kaccsal lágyan megkaparjuk. Az így kapott szuszpenzióból 0,5 cm3 mennyiséget használunk fel 50 cm3 steril, a vegetatív növekedésre ked-6 Alkotó Dextróz Baktopepton Glicerin Amber ALB1 Melasz Nadrisol Desztillált víz Mennyiség 15 g 10g 10 ti lüg 5l! 10g 1 liter 1 Az Amber ALB az Amber Laboratories. Juneau, Wisconsin 55039 tejalbumin termékének kereskedelmi neve. 2 A Nadrisol a National Distillers Products Company, New York gabona lepárló üzem szárított oldható termékének 1 5 kereskedelmi neve. E táptalaj pH-ját sterilezés előtt 5N nátriumhidroxid oldattal 7.0 7.2 értékre állítjuk be. Sterilezés után a táptalaj pH-ja 6,5-6,6. A tenyészeteket 72 órán át 30 C körüli hőmérsékleten inkubáljuk, 250 ford/perc sebességű sík rázógépen megvalósított folytonos keverés közben. Az így készített vegetatív inokulumból 20 cm3-es adaggal 40 cm3 hasonló összetételű táptalajt oltunk, amely a vegetatív növekedés második szakasza, fázisa. Az inokulum készítésnek ez a második lépése 48 óráig folyik. 30 C-on. L állandó keverés közben, amelyet 250 ford/perc sebességű sík rázógépen valósítunk meg. 42 liter, az első fázisú vegetatív inokulum táptalajjal kapcsolatban részletezettel megegyező összetételű fermentációs inokulum táptalajt, literenként 0,2 g mennyiségű , habzásgátlószerrel együtt, 30 perces, 120 C-on végrehajtott sterilezés után fermentáló tartályba, fermentorba viszünk l: táptalajhoz kb. 400 cm3 második fázisú vegetatív inokulutnot adunk. Az inokulum tenyésztése 30 C-on kb. 24 óráig folyik. Eközben 135 ford/perc sebességgel keverünk és a rendszert 18,4 l/perc sebességgel levegőztetjük. A kb. 24 órás J tenyésztés után kb. 8 liter tenyészetet használunk az alábbi összetételű 1 125 liter (250 gallon) steril termelő táptalaj beoltására; Alkotó Habzásgátló Dextróz. Szójaliszt Melasz Kalciumkarbonát Desztillált víz ad Százalék(s./tf.) " 0,02 5.00 1,50 0.30 0.25 100,0 4b A fermentációs hőmérsékletet kb. 250 ford/perc keverési és 397 litlpere levegőztetési sebesség mellett 30 C körüli hőmérsékleten tartjuk. A fermentációt kb 48 órán át folytatjuk, amikoris 472 kg dextróz 42 liter vizben készített steril oldatát adjuk hozzá. A fermentációt azután további kb. 48 órán át folytatjuk, majd befejezzük és elkezdjük az aratás műveleteit. B. Az antibiotikum keverék izolálása 900 liter mennyiségű, az A. alatt ismertetett módon kapott fermentációs levet 27 kg kereskedelmi szűrő segédanyaggal (Hyflo super-cel) együtt szűrünk és a szürlet pH-ját 5.N nátriumhidroxid oldattal 8,5-re állítjuk be. A lúgos szürletet kétszer, egyenként 0.5 térfogat kloroformmal kivonatoljuk. A kloroformos kivonatokat egyesítjük és vákuumban szárazra pároljuk. A kapott száraz maradékot feloldjuk 2 liter metilalkohnlhan. az oldhatatlan részeket kiszűrjük és eldobjuk. A metilalkoholos szűrletet vákuumban szárazra pároljuk. A kapott száraz maradékot 470 cm3 kloroformban oldjuk és az oldathoz 10 liter petrolétert adunk, aminek ö5 hatására csapadék válik ki. A csapadékot szűrjük, majd vákuumban végzett szárítás után 82.6 g nyers A-201 antibiotikum keveréket kapunk.