163865. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikumok előállítására

9 163865 10 A táptalajokba megjelelő szervetlen sókat is keverünk, nevezetesen a szokásosan alkalmazott, nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium-, foszfát-, szulfát-, klorid-, bromid-, nitrát-, karbonát- és más hasonló ionokat szolgáltató sókat. Magnézium- és vassók bekeverése, célszerűen szulfátjaik alakjában, különösen előnyös az A-201 antibiotikumkeverék termelése szempontjából. Amint az más mikroorganizmusok növekedéséhez és fejlődéséhez is szükséges, a találmány szerinti organizmusok tenyésztéséhez alkalmazott táptalajhoz ugyancsak adagolunk alapvető nyomelemekel. Ilyen nyomelemeket rrnd.'sen i tantálai más alkotóreszelt kísérő szennyezésekként adagolunk. A/ A-2U1A es A2011S antibiotikumok termelésére használt mikroorganizmus tág pH-tartomanyon belül képes a növekedésre. A mikroorganizmus tenyésztésére felhasználható különböző táptalajok pH-értéke például 6,2-tői 7,2-ig terjedhet. A legtöbb Strcptomyceshez hasonlóan a táptalaj itl is lokozatosan lúgosabbá válik és a növekedés időszakában a kb. 6.5-8.0 pH-értéket is elérheti, A növekedési időszak végén viszont a pH-értéke általában 6,8-7.2. Nagy A 201-es antibiotikumkeverék mennyiségek előállításara célszerűen nagyértékű. mely tartályokban, fermentorokban végrehajtott süllyesztett aerob fermentációt alkalmazunk. Kis antibiotikum mennyiségekéi razotl tenyészetekben kaphatunk. Ennek az antibiotikum keveréknek a termelesénél előnyös vegetativ inokulumot használni, tekintettel arra, hogv a nagy fermeniorok a mikroorganizmus spóráival történő beoltása késessel jár. A vegetatív mokulumot ezután átvisszük a nagyobb termentorba. A vegetativ inokulum növekedéséhez ugyanazt a táptalajt has/.nalhatiuk. mint a nagyban végrehajtott fermentációkhoz, alkalmazhatunk azonban más táptalaiokat is. Az A-201-termelő mikroorganizmust 30 és 50 C közötti hőmérsékleten tenyészthetjük. A legjobb antibiotikum hozamokat 35 és 40 C közötti hőmérsékleteken kapjuk. V intibiotiku- aktivitás növekedését a fermentáció ideje alatt olymódon követhetjük nyomon, hogy a fermentlé unlibiotikus aktivitásai az antibiotikumra ismerten érzékeny mikroorganizmusokkal szemben vizsgáljuk. A találmány szerinti eljárás során hasznosan alkalmazható egyik ilyen teszt mikroorganizmus a Bacillus subtiiís. A biológiai értékmérést papirkorong vagy agarlemez módszerrel végezhetjük. A mikroorganizmus hatékonyabb növekedése és a nagyobb antibiotikum termeles biztosítására a táptalajon csíramentes levegőt vezetünk keresztül. A táptalajon át szivattyúzott levegő percenkénti térfogata rendszerint a táptalaj térlogatának legalább lO'/í-a. Általában megállapítható, hogy a hullámzasos keverési eredményező mennyiség alatti értékig, annál hatékonyabb a növekedés és annál nagyobb az antibiotikum termelés, minél nagyobb a táptalajon áthajtott levegő mennyisége. A legnagyobb antibiotikus aktivitást rendszerint 72 120 óra alatt érjük el. Az, A201A antibiotikumokat szűréssel. kivonatolássaJ és adszorpciós műveletekkel nyerhetjük ki a táptalajból és választhatjuk el az esetleg jelenlévő egyéb anyagoktól. Az antibiotikus aktivitású folyadékot szűréssel választjuk el a táptalajból, illetve a növekedés közegétől. A szilárd micéliumot eldobjuk. E művelethez közönséges szűrési segédanyagot alkalmazunk. A A-201A es A-201B antibiotikumokat a szürletből szokványos, nemelegyedő oldószerrel kivonatoljuk. A kivonatolást megelőzően a szűrlet pH-értékét 5N nátriumhidroxid oldattal kb. 8.5-re állítjuk be. A kivonatolás után a nyers A-201-os antibiotikum keveréket az oldószer vákuumban végrehajtott elparologtatásával különítjük el. Az így kapott száraz maradékot metilalkoholban oldjuk fel. Az oldódás a metilalkoholban nem teljes. A fel nem oldódott anyagot kiszűrjük es eldobjuk. A metilalkoholos oldatot vákuumban szárazra pároljuk és az. így kapott száraz, maradékot kloroformban oldjuk, Ehhez az oldathoz 5 térfogat petroléterl adva, az antibiotikus aktivitású anyag csapadék alakjában válik ki. A kicsapódott nyers A-201A és A201B antibiotikum keveréket szűrjük es vákuumban szárítjuk. Az A-201A és A-201-B antibiotikum keveréket szétválasztjuk és abból izolálhatjuk az egyedi alkotókat. A szétválasztásnál úgy járunk el. hogy a keveréket feloldjuk 10 térfogat kloroformban és az oldatot szilikagéllel (Grace 62, Davison Chemical Company) töltött oszlopon kromatografáljuk. A keveréket ily módon lényegében tiszta alakú A-201A és A 20IB antibiotikumokra választhatjuk szét. Eljárhatunk azonban úgy is. hogy az antibiotikum keveréket szilikagél helyett más töltelék anyaggal, így például aktivált aluminium-' oxiddal, aktívszénnel vagy más hasonló anyaggal töltött oszlopon kromatografáljuk és választjuk szét a lényegében tiszta alakú egyedi antibiotikumokká. A kromatográfiás módszerrel kapott A 201A antibiotikumot megfelelő oldószerből végrehajtott átkristályosítással tisztítjuk tovább. A ,(1 kromatográfiás eljárással kapott A-201B antibiotikum szobahőmérsékleten folyadék. Az antibiotikum keverék szétválasztására alkalmazott kromatográfiás módszert részletesebben az alábbiakban ( ismertetjük. A petroléteres- kloroforos kivonatolásból csapadék alakja ban kapott nyers antibiotikum keveréket vákuumban szárít juk. acetonban oljduk és az oldatot szilikagéllel. például a Grace 62 védjegyezett kereskedelmi néven lorgalomba hozott •'(' (Davison Chemical Co) termékkel töltött oszlop tétjére öntjük. Az oszlopot olymódon töltjük meg, hogy a szilikagélt 1:1 arányú kloroform-aceton oldószereleggyel feliszapoljuk és entrediük. hogy a szilikagél a vivó'folyadék elfolyásakor szabadon helyezkedjék el. A töltelék leülepedése után az , oszlopot 3 térfogat 1:1 arányú kloroform-aceton oldószereleggyel mossuk. Miután az antibiotikum keverék kloroformos oldatát felvittük az oszlopra, azt újból mossuk 1 térfogat 1:1 arányú kloroform-aceton oldószereleggyel, majd a A-201A antibiotikumot acetonnal eluáljuk. Az eluátumot részletekben vesszük le az oszlopról és vizsgáljuk ezek ' antibiotikum aktivitását. Az antibiotikus aktivitású frakciókat egyesítjük és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot meleg acetonnal vesszük fel. az oldatot szűrjük és a szürletet 8 órán át 20 C-on hűtjük. A hideg acetonos oldatból kiváló csapadék az A-201A antibiotikum. A kristályokat szűréssel ,, eltávolítjuk és vákuumban szárítjuk. A szilikagél oszlopot, amelyről acetonnal minden A-201A aktivitású anyagot leoldottunk, 9:1 arányú aceton-metilalkohol oldószereleggyel eluáljuk. Az eluátumokat részletekben gyűjtjük és vizsgáljuk a frakciók antibiotikus aktivitását. Az antibiotikus hatású frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk. A maradékként 4(i visszamaradó folyadékot acetonnal mossuk és ismét szárazra pároljuk. Az oldószermentes folyadék az A-201B antibiotikum amely a színtelentől a halványbarnáig terjedő színű olajos anyag. ]•; Amint azt a megelőzó'ekben már említettük, az A-201-e antibiotikum keverék hatásos a PPLO mikroorganizmusul (pleuropneumoniaszerű mikroorganizmusok) és a Pasteurella Salmonella. Streptococcus-ok. Staphylococcus-ok és más hasonlók különböző fajai ellen és nagyszámú növénykóroko. zóval szemben fejt ki gátló hatást. A tisztított A-201A •" antibiotikum ennek megfelelően a fertőzött állatok vagy növények kezelésére szokásosan alkalmazott bármely alkalmas készítményben felhasználható. Az A-201A-t például oldatban, injekcióban adhatjuk Pasteurella spp.-vel fertőzött sertésnek, vagy a fertőzés kezelése céljából bekeverhetjük azt •y az állat takramányába vagy ivóvizébe. Az A-201B antibiotikum, amint arra már korábban rámutattunk, baktériumellenes hatású és azt felhasználhatjuk kórokozók, mint például a körtefa Erwinia amylovora okozta fertőzésének kezelésére és leküzdésére olymódon, hogy a baktérium okozta fertőzés kezelésére és leküzdésére a körtefák esetében szokásosan ""•' alkalmazott szokványos levélpermet készítményekhez A-201B-t adunk. sőt. az A-201B gombaellenes hatású is é^ alkalmazható az olyan gombák leküzdésére is. mint amilyen például a Botrytis cinerea, a számos dísznövényt és szántó földi haszonnövényt fertőző kórokozó. ól A találmányt az oltalmi kör korlátozása nélkül még a további példákkal kívánjuk szemléltetni. 5