163708. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazin jelenlétében

163708 3 4 táblázat), míg a megfelelő N-hidroxi-szukcinimidészterek előállítása során mindig képződik bizonyos mennyiségű racém termék. Ezek az (I) általános képletű aktivált észterek — ahol R a nitrogénatomon védett aminosav vagy peptid maradékát jelenti — különösen előnyösen használhatók fel a peptidszintézisben, és elkülönítésükre a szintézis során rendszerint nincs szükség. Az (I) általános képletű, új aktív észterek az adott esetben védőcsoportot tartalmazó aminosavak, illetve peptidek primer, illetve szekunder amino-csoportjaival még erős sztérikus gátlás esetén is rendkívül gyorsan reagálnak. Az N-hidroxi-szukcinimid jelenlétében végzett szintézissel ellentétben a találmány szerinti eljárás során nem képződnek melléktermékek. Ennek megfelelően a 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-l,2,3-benzotriazin jelenlétében végzett peptidszintézis során nagyobb hozammal kapunk tisztább végtermékeket. A 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazin előállítását az alábbi irodalmi anyag ismerteti: Harrison D., Smith A. C. B.: J. Chem. Soc. (London) 2157 (1960). A találmány tárgya tehát új eljárás peptidek ellőállítására. Az eljárást a peptidkémiában használahasználatos oldószerben karbodiimid jelenlétében, védőcsoportot tartalmazó aminosavakat vagy peptideket — amelyekben a reakcióba lépő karboxil-csoport szabad — adott esetben védőcsőportot tartalmazó aminosav — illetőleg peptid-észterekkel vagy ezek amidjaival — amelyekben a reakcióba lépő amino-csoport szabad — reagáltatva és a védőcsoportokat lehasítva végezzük, oly módon, hogy a) a reakcióelegybe az aminosavakra vagy a peptidekre számított 1—2 mól ekvivalens 3-hidroxi-4--oxo-3,4-dihidro-l,2,3-benzotriazint adunk, vagy b) az aminosavakra vagy a peptidekre számított 1—2 mólekvivalens 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidroxi-1,2,3-benzotriazint az aminosavak vagy a peptidek szabad karboxil-csoportjával és egy karbodiimid vegyülettel reagáltatva egy aktivált származékot állítunk elő, ezt követően a kapott vegyületet a szabad amino-csoportot tartalmazó aminosav vagy peptidkomponensekkel reagáltatjuk. Karbodiimid-vegyületként a peptidkémiában használatos vegyületeket, így diciklohexilkarbodiimidet, diizopropil-karbodiimidet és vízben oldható karbodiimid-vegyületeket, például N-ciklohexil-N'-p-(dietilaminociklohexil)-karbodiimidet vagy N-ciklohexil-N'-(jS-(N-metil-morfolinium)-etil]-karbodiimid-p-toluolszulfonátot alkalmazhatunk. Az aminosavak és peptidek reakcióképes csoportjait a peptidkémiában általánosan alkalmazott védőcsoportokkal védhetjük. Védőcsoportként polimer gyantákat, például hidroximetilpolisztirolt is felhasználhatunk (E. Schroder és K. Lübke: The Peptides, I. kötet, Academix Press, New York u. London, 1965, 108—111. oldal). Oldószerként poláros oldószereket, például dimetilformamidet, dimetilacetamidet, tetrahidrofuránt, dioxánt, piridint, dimetilszulfoxidot, foszforsav-trisz-dietilamidot vagy metilén-kloridot, illetve a felsorolt oldószerek egymással képezett elegyeit alkalmazhatjuk. A reakciót előnyösen —20 és +40 C° közötti hőmérsékleten, célszerűen mintegy 0 C°-on hajtjuk végre. A 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazin adalékanyagot nátrium- vagy káliumhidrogénkar-5 bonát-oldattal, vagy nátriumkarbonát-oldattal teljes mértékben kivonhatjuk a karboxil-csoporton védőcsoportot hordozó, vízben nehezen oldódó peptideket tartalmazó reakcióelegyből. Ennek az eljárásváltozatnak az az előnye, hogy a vizes lúgos 10 oldat megsavanyításával kicsaphatjuk a 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-l,2,3-benzotriazint, amelyet egy további szintézisben újból felhasználhatunk. Tekintettel arra, hogy az N-hidroxi-szukcinimid savakban is oldódik, az N-hidroxi-szukcinimid jelenlété-15 ben végzett peptidszintézisben az adalékanyagot nem lehet regenerálni. A 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-l,2,3-benzotriazint a nehezen oldódó peptidek mellől izopropanolos, etanolos, metanolos, tetrahidrofurános vagy forró vizes extrakcióval is elkü-20 löníthetjük. Egyes esetekben az eljárás során az (I) általános képletű, új, aktív észtereket különítjük el. A találmány szerinti eljárás további előnye, hogy jó hozammal, kristályos termék alakjában előállíthatjuk 25 a Z-treonin és Z-szerin megfelelő aktív észtereit is. Mindeddig csak rendkívül kevés aktív, kristályos Z-treonin- és Z-szerinésztert sikerült előállítani, és ezért a szerin- és treoninpeptideket eddig rendszerint az azidos eljárással állították elő, amely csak köze-30 pes hozammal megy végbe. Az azidos eljárás hátránya továbbá, hogy a Z-szerin-azidból pl. a megfelelő izocianát-vegyületen keresztül melléktermékként 4-Z-amino-oxazolidinon-2-képződik. Ha a szerin- és treoninpeptidek szintézisét kizárólag di-35 ciklohexilkarbodiimid adalékanyag jelenlétében végzik, N-acilkarbamid melléktermékek képződnek (E. Schroder és K. Lübke: The Peptides, I. kötet, Academic Press, New York és London, 1965, 208. oldal). A Z-szerin-3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-40 -benzotriazin-észter előállíthatósága azt bizonyítja, hogy ez a vegyület az alkoholízisnek nagy mértékben ellenáll. A találmány szerinti eljárással, diciklohexilkarbidiimid és 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-l,2,3-benzo-45 triazin adalékanyag jelenlétében, jó hozammal állíthatjuk elő a szabad fenolos hidroxil-csoportot tartalmazó tirozinpeptideket is. Ha a glutaminil- vagy aszparaginilpeptideket kizárólag diciklohexilkarbodiimid jelenlétében állít-50 ják elő, a savamid-csoport vízvesztése miatt jelentős mennyiségű nitril-vegyület is képződik. Az N-acil-aszparagin esetében imidképződés is lehetséges, így az aszparaginilpeptideket az ismert eljárással csak 39—45%-os hozammal állíthatják elő (E. 55 Schroder és K. Löbke: The Peptides, I. kötet, Academic Press, New York és London, 1965, 191. és 202—204. oldalak). Ha a reakcióelegyhez 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-l,2,3-benzotriazint adunk, a glutaminil- és aszparaginilpeptideket jó hozammal, 60 tisztán és gyors reakcióval állíthatjuk elő. A találmány szerinti eljárással bármely, a természetben előforduló peptidnek megfelelő, L- vagy D-konfigurációjú aminosavat pepiiddé alakíthatunk. Az eljárásban reakciópartnerként /^-aminosavakat, 65 így jß-alanint, vagy egyéb, csak szintetikusan vagy 2