163627. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sertésondó mélyhűtéses konzerválására, felmelegítésére és inszeminálásra
163627 3 melegítjük fel oly módon, hogy az ondósejtek a mélyhűtési eljárás során inaktivált állapotban vannak. Csak az inszemináláskor mobilizáljuk az ondósejteket egy úgynevezett „ébresztő oldat" alkalmazásával. Az inaktiválást előnyösen glukózt és pufferanyagot tartalmazó vizes oldattal végezzük. A találmány egyik különösen előnyös foganatosítás] módja esetén a felmelegítést a kívánt előhígítás eléréséhez szükségesnél kisebb mennyiségű hígítóval végezzük és a végleges hígítást az előhígított oldathoz az ondósejteket mobilizáló oldat hozzáadásával hajtjuk végre. Legkedvezőbbnek az bizonyult, ha a felmelegítést 60—70 C° hőmérsékletű hígítóval végezzük. Előnyösen a felmelegítést 60—70 C° hőmérsékletű inaktiváló oldattal végezzük. Az ondósejteket mobilizáló oldatként nátriumsót, kalciumsót, glukózt, pufferanyagot és szulfonamidot tartalmazó vizes oldat bizonyult különösképpen alkalmasnak. Igen előnyös, ha a véghígítást csak az uterusban végezzük, amikoris először az előhígított ondót visszük be, és ezt követően vezetjük be az ondósejteket mobilizáló oldatot. A centrifugált ondó hígítása a mélyhűtés előtt mélyhűtő hígítóval végezhető, amely fruktózt, citromsavat, tojássárgáját, glicerint és pufferanyagot tartalmazó vizes oldat. Általában a mélyhűtést úgy hajtjuk végre, hogy a mélyhűtő hígítóval elkevert ondót először 1 1/4— 1,5 órán át 5 C° hőmérsékleten tartjuk, majd C02 szárazjégre csepegtetjük úgy, hogy kis golyócskák keletkeznek, melyeket azután folyékony nitrogén vesz körül. Ennek során a golyócskák mélyhűtése olyan hígítóval történhet, hogy a golyócskákra a megtermékenyítéshez szükséges mennyiség jut. A találmányt a következőkben egy különösen előnyös kiviteli példa kapcsán ismertetjük részletesebben. Az ejakulátumot közvetlenül levétel után körülbelül 36 C° hőmérsékletű inaktiváló oldattal 1:3 arányban hígítjuk. Az inaktiváló oldat példaképpen a következő összetételű lehet: 87,5 g -d-glukóz 5,4 g etiléndinitrilotetraecetsavdihidrát 5.4 g nátriumcitrát 7.5 g nátriumhidrogénkarbonát 1000 ml kétszer desztillált vízhez. A hígított ondót centrifugáló edénybe töltjük, és szobahőmérsékleten 1,5—2 órán át állni hagyjuk. Ez alatt az idő alatt a hőmérséklet szobahőmérsékletre csökken és a magsejtek immohilizálódnak. Ezután a centrifugáló edényt óvatosan centrifugába helyezzük és 7 percig kb. 2500 ford/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. Az edénynek a centrifugából való kiemelése után a fennmaradó folyadékot az edény billentésével teljesen leöntjük. Az üledéket azután mélyhűtő hígítóval 1:3 arányban hígítjuk. Az alábbiakban megadjuk a találmány szerint alkalmazható mélyhűtő hígító előnyös összetételét. 6,06 g Trisz(hidrometil)aminometán 2,50 g Fruktóz 3,46 g Citromsav 10,00 ml Glicerin 25,00 ml Tojássárgája 200 ml kétszer desztillált vízhez. 4 Az ondót és a hígítót üvegpálcával óvatos keverés közben alaposan elkeverjük. A hígított ondót azután hűtőszekrényben 1,5, maximum 2 óráig körülbelül 5 C° hőmérsékletre hűtjük, utána a hígított S ondót pipetta segítségével cseppenként C02 szárazjégre öntjük, és a cseppek 5 percen belül kis golyócskákká fagynak. Ezeket a golyócskákat azután folyékony nitrogénbe helyezzük. Ha az ondót fel kívánjuk használni, azt a talál-10 mány szerint úgy melegítjük fel, hogy minden esetben 20—30 golyócskát — ez a mennyiség szükséges egy megtermékenyítéshez — 20—30 ml (golyócskánként 1 ml) 60—70 C° hőmérsékletű inaktiváló oldathoz adagolunk. Az összes golyócskát az 15 egyes megtermékenyítési adaghoz egyszerre adjuk az inaktiváló oldathoz. A golyócskák az edény enyhe rázására azonnal feloldódnak. A feloldódás során az oldat hőmérséklete kb. 35-40 C°-ra csökken. Az oldat tehát felmelegített hígított ondó. 20 Az ondót ezután inszemináljuk, vagyis bejuttatjuk az uterusba. Ezt követően 75 ml az ondósejteket mobilizáló „ébresztő" oldatot, amelyet szintén körülbelül 40 C°-ra melegítettünk, öntünk az ondóoldathoz. Az alkalmazott, az ondósejteket mobili-25 záló ébresztő oldat célszerűen a következő összetételű lehet: 24,3 g Nátriumcitrát X 2 HaO 2, g Nátriumkarbonát 30 0,4 g Káliumklorid 3,0 g Glukóz 3,0 g Szulfanilamid 1000 ml kétszer desztillált vízre vonatkoztatva. 35 Az ébresztő oldatot úgy állítjuk elő, hogy az egyes komponenseket összeöntjük, majd az anyagot 10 percen át, 90 C°-on hevítjük. Az ilyen módón előállított ébresztő oldat steril tárolás esetén hosszú ideig eltartható. 40 A találmány szerinti eljárással igen jelentős haladást érhetünk el, mert ennek alkalmazásával válik először lehetővé, hogy a mesterséges megtermékenyítés sertéseknél is gazdaságosan megvalósítható legyen. 45 A kísérletek során minden egyes eljárási lépés után próbákat vettünk, és ezt az ondósejtek életképessége vonatkozásában mikroszkopikus vizsgálatnak vetettük alá. A végső szakaszban az ondósejtoldat 50 -70%-os mozgékonyságot mutatott, 50 míg az eddig ismert eljárással maximálisan 30%-os mozgékonyságú ondósejtoldatot tudtunk előállítani. A találmány szerinti eljárással előállított ondósejtoldatok jó termékenyítő hatásúak, és átlagban 9—10 malacos eilest eredményeztek. 55 Feltételezhető, hogy a találmány szerinti eljárásnál alkalmazott azonnali inaktiválás, tehát az ondó anyagcseréjének csökkentése, közvetlenül az ondósejtek levétele után a mélyhűtés kezelés során az ondósejtek nagyobb ellenálló képességét bizto-60 sítja. A találmány vonatkozásában azonban igen lényeges a felmelegítés módja is. A golyócskákat nem testmeleg, hanem 60—70 C° hőmérsékletű oldatba adagoljuk, mivel pedig a kb. —190 C° hőmérsékletű golyócskák az oldatba jutva azt lehűtik, 65 a találmány szerinti eljárás során megközelítően 2
