163626. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-triozin-O-szulfát-csoportot tartalmazó oktapeptidek előállítására
163626 5 dékot szűréssel elválasztjuk, és vákuumban szárítjuk. Súlya 1,2 g. 270 mg terc-butoxikarbonil-L-aszparagil-L-tirozin-hidrazidot 2,6 ml dimetilformamidban oldunk, és 5 percre — 15°-ra hűtjük. 0,31 ml tömény sósavat adunk hozzá, és a hó'mérsékletet 5 percig — 15°-on tartjuk. Ezután 0,325 ml 14%-os nátriumnitrit-oldatot adunk hozzá, és 5 perc múlva a hó'mérsékletet —20°-ra csökkentjük. A reakciókeverékhez 0,675 ml N-etilpiperidint adunk, majd hozzáadjuk az eló'zó' bekezdésben készült 0,620 g trifluoracetát 2,6 ml dimetilformamiddal készült oldatát. A reakciót mintegy 0°-on 24 óra hosszat mechanikus keverés közben lezajlani hagyjuk. Elkészítjük az előbb leírt módon előállított azidoldat fele menynyiségét, és hozzáadjuk a reakciókeverékhez, majd további 12 óra állás után hozzáadjuk az eredeti azidoldatnak megfelelő' mennyiség 1/4-ét. A reakciókeveréket 51 óra hosszat állni hagyjuk, majd 3% ecetsavat tartalmazó 35 ml jeges vízbe öntjük. A kicsapódott oktapeptidet szűréssel elválasztjuk. A terméket 15 ml etilalkohol és 5 ml víz elegyében átkristályosítjuk, és vákuumban szárítjuk. Súlya 366 mg. Olvadáspontja 188—190°. d) L-Aszparagil-O-szül fat o-L-tirozil-L-leucil-glicil-L-triptofil-L-leucil-L-aszparagil-L-fenil alanin -amid A c) szakaszban készült 366 mg oktapeptidet feloldjuk 17 ml vízmentes dimetilformamid és 17 ml frissen desztillált piridin elegyében. Az oldathoz hozzáadjuk 875 mg piridin-kéntrioxíd komplexnek 17 ml dimetilformamiddal készült oldatát. A reakciókeveréket szobahőmérsékleten 17 óra hosszat állni hagyjuk, majd vákuumban bepároljuk. A maradékot több ízben 15—15 ml vízzel mossuk, és vákuumban szárítjuk. Súlya 318 mg. A nyers termék hez 5 ml trifluorecetsavat adunk, majd 20 perc múlva a savat vákuumban eltávolítjuk, a kapott trifluoracetátot dietiléterrel digeráljuk és szárítjuk. A nyers oktapeptid-szulfátot feloldjuk 0,1 mólos ammóniumkarbonát oldatban, és DEAE-Sephadex A-25 oszlopon kromatografálva tisztítjuk. Aminosav-összetétele: Asp (2,19); Gly (1,0); Leu (2,19); Tyr (1,05); Phe (1,06). Ultraibolya spektrum: Amax288 mu (E 3690). 2. példa Aszparagil-O-szulfato-L-tirozil-L-leucil-glicil-L-triptofil-L-metionil-L-aszparagil-L-fenilalanin-amid a) terc-Butoxikarbonil-L-leucil-glicil-L-triptofil-L-metionil-L-aszparagil-L-fenilalanin-amid terc-Butoxikarbonil-L-leucin-p-nitrofenilésztert az 1. példa b) szakaszában leírt módon glicil-L-triptofil-L-metionil-L-aszparagil-L-fenilalanin-amiddal reagáltatva a címben megnevezett hexapeptidet kapjuk. Olvadáspontja 70%-os etanolból átkristályosítva 199—201°. 6 b) terc-Butoxikarbonil-L-aszparagil-L-tirozil-L-leucil-glicil-L-triptofil-L-metionil-L-aszparagil-L-fenilalanin-amid 5 terc-Butoxikarbonil-L-aszparagil-L-tirozin-hidrazidot az 1. példa c) szakaszában leírt módon L-leucil-glicil-L-triptofil-L-metionil-L-aszparagil-L-fenilalanin-amiddal reagáltatva a címben megne-10 vezett oktapeptidet kapjuk. Olvadáspontja 70%-os etanolból átkristályosítva 168—170°. c) L-Aszparagil-O-szulfato-L-tirozil L-leucil-glicil-L-triptofil-L-metionil-L-15 -aszparagil-L-fenilalanin-amid 500 mg (0,43 mmól) b) szakaszban kapott oktapeptidet feloldunk 51,5 ml vízmentes dimetilformamid és 51,5 ml frissen desztillált piridin elegyében. Ehhez az oldathoz hozzáadjuk 1,37 g piridin-20 kéntrioxid komplexnek 51,5 ml dimetilformamiddal készült oldatát. A keletkezett oldatot szobahőmérsékleten 18 óra hosszat állni hagyjuk, majd vákuumban bepároljuk. A száraz maradékot több ízben 15—15 ml vízzel mossuk, és vákuumban szárítjuk. 25 Kitermelés 372 mg. A nyers vegyülethez 5 ml triklórecetsavat adunk, majd 20 perc múlva a savat vákuumban eltávolítjuk, a trifluoracetátot dietiléterrel digeráljuk, és szárítjuk. A nyers oktapeptid-szulfátot 0,1 mólos ammóniumkarbonát oldatban 30 oldjuk, és DEAE-Sephadex A-25 oszlopon kromatografálva tisztítjuk. Az 1 cm átmérőjű és 30 cm magas oszlopot 350 ml 0,1 mólos és 350 ml 1,5 mólos ammóniumkarbonát oldatokból készült lineálisan fokozódó koncentrációjú 5 ml-es oldatada-35 gokkal eluáljuk, az 5 ml-es frakciókat gyűjtjük, és megállapítjuk az ultraibolya abszorpciójukat 253 mu-nál. A 12—38. frakciókat egyesítjük, és liofilizálva 160 mg cím szerinti terméket kapunk. Savas hidrolízissel kapott aminosav-összetétele: 40 Asp (2,05); Gly (1,0);, Met (0,95); Leu (1,05); Phe (1,10); Ultraibolya spektrum: Amax288mn (E 3950). 3. példa 45 L-Aszparagil-O-szulfato-L-tirozil-L-metionil-glicil-L-triptofil-L-leucil-L-aszparagil-L-fenilalßnin-amid / a) terc-Butoxikarbonil-glicil-L-triptofil-L-leucil-L-aszparagil-L-fenilalanin,0 -amid 500 mg terc-butoxikarbonil-L-triptofil-L-leucil-L-aszparagil-L-fenilalanin-amidot feloldunk 5 ml trifluorecetsavban, és 20 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a reakciókeverékhez 100 ml 55 étert adunk, a keletkezett csapadékot szűréssel elválasztjuk, és vákuumban szárítjuk. Súlya 503 mg. Az így kapott 503 mg trifluoracetátot feloldjuk 8 ml dimetilformamidban, és jégfürdőben hirtelen lehűtjük. Hozzáadunk 0,25 ml trietilamint, majd 60 295 mg terc-butoxikarbonil-glicin-p-nitrofenilésztert, és a keveréket szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni. 4,5 óra múlva további 25 mg aktív észtert adunk hozzá, és a reakciókeveréket éjjelen át reagálni hagyjuk. Ezután lassan beleöntjük 0,5 ml 65 ecetsavat tartalmazó 50 ml jeges vízbe. A csapadé-3
