163588. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 7béta- (D-5-amino-5-karboxi-valeramido) -3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-CEF-3-AM-4-karbonsav antibiotikum előállítására
163588 15 A meghatározást a fentebb már ismertetett korong-módszerrel végeztük, 1,2 cm átmérőjű szűrőpapír-korongok alkalmazásával. A meghatározás céljaira Difco-tápközeges ágár-lemezeket készítettünk, 2,0 g/liter Difco-élesztőkivonat hozzáadásával. Lemezenként 10 ml ágár-tápközeget alkalmaztunk. A tápközegben, amely 0,2% élesztőkivonatot tartalmazott, a meghatározás céljaira alkalmazott Vibrio percolans MB—1272 mikroorganizmust éjjelen át szaporodni hagytuk, majd a közeget steril sóoldattal oly mértékben hígítottuk, hogy a kapott szuszpenzió optikai áteresztése 660 millimikron hullámhosszon 40% legyen. Ezt a szuszpenziót azután literenként 20 ml mennyiségben adtuk az ágáros tápközeghez, a lemezek kiöntése előtt. A fenti módon, öntéssel készített ágár-lemezeket felhasználásig 4 C° hőmérsékleten tartottuk (az elkészített lemezek legfeljebb 5 napig tárolhatók felhasználás előtt). A meghatározás során az antibiotikumot tartalmazó oldattal átitatott szűrőpapír-korongokat ráhelyeztük a lemez felületére, majd a lemezt 8—24 óra hosszat inkubáltattuk 28 C° hőmérsékleten. A kialakult gátlási zónák átmérőjét mm-ben mértük, és ennek alapján határoztuk meg az antibiotikumot tartalmazó oldat viszonylagos aktivitását, ill, egy tisztított ismert standard-mintával való összehasonlítás alapján mcg/ml értékekben adtuk meg az oldat antibiotikum-tartalmát. Az ily módon végzett kvantatív meghatározás útján 1—2 meg/ml antibiotikum mutatható ki. A 842A antibiotikum inaktiviálása baktériumok által: A 842A antibiotikumoknak a baktériumok inaktiváló hatásával szembeni ellenállóképességét in vitro kísérletben vizsgáltuk, a C-cefalosporin, cefaloridin és cefalotin ilyen irányú képességével öszszehasonlítva. E vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a 842A antibiotikum stabilabb az említett inaktiváló hatással szemben, mint az említett ismert antibiotikumok. E vizsgálatok során két olyan mikroorganizmustörzset alkalmaztunk, amelyekről ismeretes, hogy a C-cefalosporint teljesen inaktiválják; ezek az Alcaligenes faecalis MB—9 és Alcaligenes viscous MB—12 törzsek voltak. a) A baktérum-sejtek előállítása: Az Alcaligenes viscosus MB—12 és Alcaligenes faecalis MB—9 mikroorganizmusok sejtjeit oly módon készítettük elő, hogy az inokulum-kultúra mintáját néhány ml 0,2% élesztőkivonatot tartalmazó tápközeggel elkevertük, majd a kapott szuszpenzió oltókacsnyi mennyiségét egy ferde ágáros tápközeg felületére kentük és 18 óra hosszat inkubáltuk 37 C° hőmérsékleten. Az e célra alkalmazott ágár-tápközegeket 5 C° hőmérsékleten tartottuk a beoltás után és legfeljebb egy hétig inkubáltuk. Az agár felületén kifejlődött kultúrából egy oltókacsnyi mennyiséget aszeptikus úton átvittünk 50 ml 0,2% élesztőkivonatot tartalmazó tápközegbe, majd 18 óra hoszszat 28 C° hőmérsékleten rázattuk a kultúrát. Ezután 10 percig centrifugáltuk, percenkint 4000 fordulattal. A szupernatáns folyadékot dekantálással eltávolítottuk és a vissszamaradt sejt-üledéket 0,1 mólos foszfát-pufferoldattal — amelyet előzőleg 16 sterilizáltunk —- kétszer mostuk. Az e célra alkalmazott foszfát-pufferoldat összetétele a következő volt: 6,8 g KH2 P0 4 és 7,1 g nátriumhidrogénfoszfát 1 liter desztillált vízben. 5 A fenti módon mosott sejteket azután újból szuszpendáltuk, az eredeti térfogat egytizedét kitevő, 4 mg/ml koncentrációjú antibiotikum-oldatban (ezt az oldatot is 0,1 mólos foszfát-pufferoldattal készítettük). Az elegyet ezután rázás nélkül, 10 vízfürdőben, 37 C° hőmérsékleten 4 óra hosszat inkubáltuk. Utána percenkint 200 fordulattal 10 percig centrifugáltuk az elegyet, és így tiszta szupernatáns folyadékot kaptunk, amelyet steril kémcsövekbe töltöttünk és szárazjéggel azonnal meg-15 fagyasztva tároltunk a biológiai meghatározás elvégzéséig, amit általában 3 órán belül folytattunk le. Összehasonlításul kontroli-mintákat is inkubáltunk ugyanilyen módon, de baktérium-sejtek hozzáadása nélkül. 20 b) A 842A antibiotikum inaktiválásának mértéke: A szupernatáns folyadékban az antibakteriális aktivitást oly módon határoztuk meg, hogy 0,6 cm átmérőjű szűrőpapír-korongokat megnedvesítettünk ezzel a folyadékkal, majd ezeket a nedves 25 korongokat ráhelyeztük egy megfelelő vizsgálati mikroorganizmussal előzőleg beoltott tápközegágárlemezek (0,2% élesztőkivonat-tartalommal) felületére. Vizsgálati mikroorganizmusként Bacillus subtilis MB 964 törzset alkalmaztunk és a leme-30 zekét oly módon oltottuk be, hogy a mikroorganizmus mosott spóráinak 0,9%>-os sóoldattal készített szuszpenziójából 5 ml mennyiséget adtunk 150 ml ágáros tápközeghez (2%-os élesztőkivonattartalommal), 45 C° hőmérsékleten. Az így beol-35 tott tápközegből 5—5 ml-es adagokat töltöttünk 15x100 mm méretű Petri-csészébe. Az így kiköntött lemezeket 5 C° hőmérsékleten tároltuk és 3 napon belül felhasználtuk őket. A vizsgálandó aktivitású oldattal átitatott szűrőpapír korongok 40 ráhelyezése után az ágár-lemezeket éjjelen át inkubáltattuk 25 C° hőmérsékleten, majd mértük a szűrőpapír-korongok körül kialakult gátlási zónák átmérőjét. Mindegyik vizsgált antibiotikummal kontroll-45 vizsgálatokat is végeztünk baktérium-sejtek hozzáadása nélkül, 1:1, 1;2, 1:4, 1:8, 1:16 és 1:32 hígításban, hogy a kapott eredmények alapján felvehessük a standard vonatkoztatási görbét. A baktérium-sejtek hozzáadásával inkubált mintákat 50 hígítás nélkül alkalmaztuk. Valamennyi meghatározást három párhuzamos kísérletben végeztünk. c) Eredmények: A mért gátlási zónák átmérőjének a három párhuzamos kísérlet alapján számított 55 átlagértéke alapján számítottuk ki az inaktiválódási százalékarányt az egyes antibiotikumok esetében, és az említett standard vonatkoztatási görbe alapján meghatároztuk a vizsgált oldatban visszamaradt, nem inaktiválódott antibiotikum mennyi-60 ségét. Az így kapott értéket azután levontuk a kiinduló koncentrációból (4 mg/ml), és a maradékot elosztottuk a kiinduló koncentrációval és 100-zal szoroztuk: így %-ban kaptuk meg inaktiválódás mértékét. A kapott eredményeket az alábbi táb-65 lázaiban foglatuk össze: 8
