163464. lajstromszámú szabadalom • Szögmérőműszer, két tengely körül elforgatható irányzókészülékkel

5 163467 6 A proteolitikus aktivitást kazeinoldó egységekben (CE) kifejezve Kunitz módosított eljárásával [J. Gen. Physiol. 30, 291(1947)] 8,0 pH-értéken határoztuk meg. Az enzim fibrinolitikus aktivitását fibrin-lemezeken Astrup T. és Müllertz S. [Arch. Biochem. Biophys. 40, 5 346 (1952)] módszere szerint határoztuk meg. A fibrinolitikus aktivitás mértékéül a 18 órás, 37 C°-on végzett inkubálás után nyert fibrinolitikus udvar átmérője szolgál. A találmány szerint Aspergillus ochraceusból izolált 10 0,0002 mg proteáz, illetőleg 0,001 mg kristályos tripszin a fibrin-lemezeken 16 mm-es átmérőjű udvart ad (0,05 M tris-HCl-puffer, 0,005 M CaCl2, pH: 7,4). Az Aspergillus ochraceus proteáz a tripszinhez viszonyítva ötszörös fibrinolitikus hatással rendelkezik. 15 A találmány szerinti eljárás kiviteli módját közelebbről az alábbi példák szemléltetik: 1. példa 20 Aspergillus ochraceus tenyészetéből tanninos kicsapással izolált 50 g, 1,4 CE/mg proteolitikus összaktivitású nyers enzimkeveréket 4 x 200 ml 0,05 mólos trisz-HCl-puíferal (pH =7,2) 15 percen át mechanikai keveréssel extrahálunk. Az extrahált keveréket tisztára centrifugál- 25 juk. (15000 g). A tiszta, sötétbarna színű, hatóanyagtartalmú oldatokat egyesítjük. Az össztérfogat 750 ml. A fenti teljes oldatmennyiséget 0—4 C°-on DEAESephadex A—50 anioncserélővel töltött oszlopon (10 x 18 cm) szűrjük, majd az oszlopot 7,2 pH-értékű 30 0,05 mólos trisz-HCl-pufferral mossuk. Az ioncserélőágy elkészítését úgy végezzük, hogy 50 g DEAE-Sephadex A—50 anioncserélőt 7,2 pH-értékű 0,05 mólos trisz-HCl-pufferral egyensúlyba hozunk. 35 A fenti, még gyengén színes, hatóanyagtartalmú szűrletből (kb. 3500 ml) a hatóanyagot háromszoros térfogatú —20 C°-ra lehűtött etanollal kicsapjuk. A hatóanyag tökéletes leválása céljából a csapadékos folyadékot éjszakán át —20 C°-on tartjuk, majd a csa- 40 padékot centrifugálással elkülönítjük, etanollal és acetonnal mossuk és vákuumban szárítjuk. 4,43 g, 11,6 CE/mg aktivitású fibrinolitikus hatású, proteázban dúsított terméket kapunk. Ennek 1,5 g-ját 8 ml deszt. vízzel elegyítjük, átkever- 45 jük és az oldhatatlan maradéktól centrifugálással (5000 g) elkülönítjük. A tiszta, barnás színű extraktumot 0—4 C°on vízzel duzzasztott Sephadex G—75 géllel töltött oszlopon (2,5x95 cm) szűrjük és desztillált vízzel eluáljuk. Az oszlopról levett eluátumot 20 ml-es 50 frakciókban fogjuk fel. 220 ml inkatív előszűrlet után, a 12—18. frakciók hatóanyagot tartalmaznak, a színezékek és a kisebb molekulasúlyú fehérjék pedig az oszlopon maradnak. A hatóanyagot tartalmazó oldatot (140 ml) liofilizál- 55 juk. 616 mg, 15,7 CE/mg fajlagos proteolitikus aktivitású, könnyen oldható, száraz, fehér port kapunk. A kiadásért felel: a Közgazdasági 2. példa Aspergillus ochraceus-ból tanninos kicsapással izolált 20 g, 1,0 CE/mg proteolitikus összaktivitású nyers enzimkeveréket az 1. példa szerint extrahálunk. A tiszta, sötét színű, hatóanyagtartalmú oldatot (290 ml) DEAE-Cellulose anioncserélővel töltött oszlopon (4,5 x 15 cm) — melyet 7,2 pH-értékű, 0,05 mólos trisz-HCl-pufferral egyensúlyba hoztunk — szűrjük át. Végül az oszlopot 0,05 mólos trisz-HCl-pufferral (pH =7,2) mossuk. A hatóanyagtartalmú szűrletből (kb. 400 ml) a hatóanyagot az 1. példában leírt módon kicsapjuk. Ekkor 3,19 g, 4,5 CE/mg aktivitású, fibrinolitikus hatású, proteázban dúsított terméket kapunk, amelyet nagytisztaságú hatóanyag előállítása céljából az 1. példa szerint gélkromatográfiának vetünk alá. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás fibrinolitikus aktivitású proteáz izolálására penészgombatenyészetekből, az Aspergillus ochraceus tenyészetéből (IMET PA. Nr. 126) tanninos kicsapással elkülönített nyers enzimkeveréket vizes pufferoldattal extrahálva, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagtartalmú extraktumot kevéssé térhálós dextrán dietilaminoetilszármazékon vagy dietilaminoetil-cellulózon mint anioncserélőn szűrjük át, a hatóanyagtartalmú szűrletből a hatóanyagot vízzel elegyedő szerves oldószerrel kicsapjuk, a csapadékot vákuumban szárítjuk, vízben oldjuk, majd 7—11 ml/g vízfelvevőképességű térhálós dextrángélen kromatografáljuk és a fibrinolitikus aktivitású proteáz tartalmú frakciókat liofilizáljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az Aspergillus ochraceusból elkülönített nyers enzimkeveréket 6,5—7,5 pH-értékű, előnyösen 7,0—7,2 pH-értékű 0,05—0,1 mólos trisz-HCl-pufferral vagy 0,05—0,1 mólos ammóniumacetát-pufferral extraháljuk. 3. Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagtartalmú extraktumot 0,5—0,9 mekv./g kapacitású kevéssé térhálós dextrán dietilaminoetil-származék vagy dietilaminoetil-cellulóz anioncserélővel töltött, az extraháló pufferral egyensúlyba hozott oszlopon, előnyösen 0—4 °C-on szűrjük át, az anioncserélőt a pufferral mossuk és a hatóanyagot a szűrletből vízzel elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen —20 C°-ra lehűtött, 1: 3 arányban alkalmazott etanollal csapjuk ki. 4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az anioncserélővel végzett kezelés után kapott anyagot kevés vízben feloldjuk, 7—-11 ml/g vízfelvevőképességű térhálós dextrángéllel töltött oszlopon, előnyösen 0—4 e'en kromatografáljuk, vízzel eluáljuk, az eluátumot frakciókban összegyűjtjük és a fibrinolitikus aktivitású proteáz tartalmú frakciókat liofilizáljuk. Jogi Könyvkiadó igazgatója 76.3495.66-42 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató