163464. lajstromszámú szabadalom • Szögmérőműszer, két tengely körül elforgatható irányzókészülékkel
3 163467 4 Sephadex G—25 oszlopon szűrik, majd az aktív eluátumot liofizálják. A 3 281 331 sz. USA-beli szabadalmi leírás eljárást közöl fibrinolitikus hatású proteáz előállítására, amit oly módon végeznek, hogy az Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus vagy Absidia coerulea nyers enzimkeverékeinek oldatából a hatóanyagot 5,5 pH-értéken CM-Cellulose vagy CM-Sephadex oszlopon abszorbeálják, pufferral 7 pH-értéken eluálják, majd dialízis után liofllizálják, vagy pedig a hatóanyagot tanninnal kicsapják, 6 pH-értéken DEAE-Cellulose oszlopod adszorbeálják és a sókoncentráció fokozatos növelése mellett pufferral eluálják. A Chemical Abstracts 54, 17549 d referátuma egy eljárást ismertet, amely szerint Aspergillus ochraceus korpakultúráját 0,75%-os nátriumklorid oldattal extrahálják, és a hatóanyagot az alábbi művelet-sorral tisztítják: kalciumacetát és ammóniumszulfát oldattal kicsapást végeznek, ammóniumszulfáttal extrahálnak, káliumcianid oldattal szemben dializáinak, rivanollal kicsapást végeznek, Amberlite IRC—50-en kromatografálnak, acetonnal és rivanollal kicsapást végeznek, Amberlite IRC 50-nel ismételten kromatografálnak, acetonnal frakcionált kicsapást végeznek, majd etanol tartalmú oldatból kristályos alakban egy proteolitikus enzimet nyernek ki. A Chemical Abstracts 56, 5103 b referátumban az Aspergillus ochraceusból nyert proteáz preparátum tisztítását írják le. A termék fibrinolitikus hatására vonatkozóan azonban nem közölnek adatokat. A tisztítás során az alábbi műveleteket alkalmazzák: kisózás, oldósueres frakcionálás, kalciumfoszfátgéles adszorpció, ezeket a műveleteket a találmány szerinti eljárásban nem alkalmazzuk. A Chemical Abstracts 65, 4548 e referátum egy fermentációt ismertet, amelyhez Aspergillus ochraceus törzset alkalmaznak. A fermentáció során ellenőrzik a proteolitikus aktivitás csökkenését. Proteázok elkülönítésére azonban nem tettek kísérletet. Az összes ismert eljárások a fibrinolitikus hatású proteázoknak Aspergillus oryzae, Aspergillus terricola, Aspergillus flavus, Aspergillus awamori vagy Absidia coerulea gombákból történő izolálására vonatkoznak. A leírt módszerek a proteázok különböző molekulaszerkezete és az ebből adódó specifikus fizikokémiai tulajdonságai következtében a fibrinolitikus hatású enzimnek csak a megadott penészgombafajból történő izolálására használhatók. Némely módszer ezenkívül csak részlegesen tisztított proteázpreparátumot eredményez, ami terápiás felhasználhatóságukat korlátozza. A találmány célja eljárás kidolgozása fiziológiás körülmények között optimális fibrinolitikus hatású, nagytisztaságú proteáz gazdaságos izolálására Aspergillus ochraceusból. Az így kapott proteáz a terápiában külsőleg és parenterálisan toxikus mellékhatások nélkül alkalmazható. A találmány feladata az Aspergillus ochraceus nyers enzimkeverékéből nagytisztaságú fibrinolitikus hatású proteáz izolálása. Mindenekelőtt szükség volt ehhez egy olyan módszerre, amellyel a proteáz a fibrinolitikusan inaktív proteázoktól, ballasztfehérjéktől és zavaró színezékek mellől gazdaságosan izolálható. A találmány tárgya eljárás nagytisztaságú fibrinolitikus hatású, toxikus mellékhatásók nélkül terápiásán alkalmazható proteáz előállítására, oly módon, hogy az Aspergillus ochraceus tenyészetéből tanninos kicsapással izolált nyers enzimkevéréket vizes pufferoldattal 5 extraháljuk, a hatóanyagtartalmú extraktumot kevéssé térhálós dextrán dietilaminoétil-származék vagy dietilaminoetil-cellulóz (DEAE-Sephadex vagy DEAE-Cellu, lose) anioncserélőn szűrjük, a hatóanyagtartalmú szűrletből a hatóanyagot vízzel elegyedő szerves oldószerrel 10 kicsapjuk, a csapadékot vákuumban szárítjuk, vízben oldjuk, majd (Sephadex G—75 vagy Sephadex G—100) térhálós dextrángéjen kromatografáljuk és a proteáztartalmú frakciókat liofilizáljük. A nyers enzimkeverék tisztítását úgy végezzük, hogy I5 a nyers preparátumot, melynek proteolitikus aktivitása kb. 1 CE/mg, 6,5—7,5 pH-értékű trisz-HCl-pufferral vagy 6,5—7,5 pH-értékű 0,05—0,1 mólos ammóniumacetát pufferral szobahőmérsékleten többször kikeverjük és ily módon a hatóanyagot tökéletesen feloldjuk. 2° Centrifugálással (15000 g) tiszta, sötét színű, hatóanyagtartalmú, az oldhatatlan inaktív részektől elkülönített oldatot állítunk elő. Fenti hatóanyagtartalmú extraktumot előnyösen 0—4 C°-on 0,5—0,9 mekv./g kapacitású kevéssé térhálós dextrán dietilaminoétil-származék vagy dietilaminoetil-cellulóz anioncserélő oszlopon szűrjük. Ezt követően az ioncserélőt az extraháláshoz használt pufferral mossuk. 30 Az ariioncserélővel végzett kézéléssel a ballasztfehérjéket, a fibrinolitikus terápiához nem megfelelő proteázokat, valamint a színezékek legnagyobb részét megkötjük. A fibrinolitikus hatású proteázok nem adszorbeálódnak; ezeket a fenti módon kapott ható-35 anyagoldatból háromszoros mennyiségű, —20 C°-ra lehűtött, vízzel elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen etanollal kicsapjuk és vákuumban szárítjuk. A hatóanyagtartalmú anyagot lehetőleg kevés vízben feloldjuk és kromatografáljuk oly módon, hogy az 40 oldatot előnyösen 0— +4 C°-on 7—11 ml/g vízfelvevőképességű térhálós dextrángéllel (Sephadex G—75 vagy G—100) töltött oszlopra visszük, majd az oszlopot vízzel eluáljuk. Az eluálásnál kapott frakciók proteolitikus aktivitását megmérjük. Az aktív frakciókat 45 liofilizáljük. Száraz fehér por alakjában tiszta fibrinolitikus hatású proteázt kapunk, amelynek proteolitikus aktivitása kb. 15 CE/mg. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy az Aspergillus ochraceusból kapott nyers enzimkeverékből 50 egyszerű technikai segédeszközökkel fiziológiás körülmények között aktív, nagy tisztaságú, fibrinolitikus hatású proteázt izoláljunk. A találmány szerinti eljárás haladó jellegét igazolják az elért hozamok. A tisztítás első fázisában (extrahálás, 55 szűrés, a hatóanyag kicsapása) a hozam az 1. példában az aktivitások alapján 73,4%. A tisztítás második fázisában (gélkromatográfia és a hatóanyagtartalmú eluátum liofilizálása) az 1. példában a hozam az aktivitások alapján 55,6%. Kb. 11-szeres töményítésnél a két tisztí-60 tási fázisban az összes aktivitás-hozam 40,8%. A találmány szerint izolált fibrinolitikus enzimek elektroforézissel egységesek. A fibrinolitikusan aktív proteáz külsőleg vagy parenterálisan alkalmazva, terápiás körülmények között 65 semmiféle toxikus mellékhatást nem okoz.
