163453. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-amino-3-metil-delta3-cefem-4-karbonsav előállítására
7 163453 8 aeilező enzimet termelő törzs sajátságainak megfelelően választjuk meg, a következő szempontok figyelembevételével: .a) a hordozóanyagnak inaktiválódás nélkül kell adszorbeálnia az enzimet, b) a hordozóanyagról az enzim vizes mosással vagy hasonló kezeléssel nem távolítható el, -c) a hordozóanyag nem gyakorol káros hatást az (I) általános képletű vegyületek dezacilezési reakciójára, és i d) a hordozóanyag a képződött 7-ADCA-t csekély mértékben vagy egyáltalán nem adszorbeálja. •Vizsgálataink szerint a Bacillus megaterium B—400 törzs által termelt enzim szervetlen hordozóanyagokon, pl; celiten, fehér agyagon, aktivált agyagon, kaolinon, aktív szénen és szilikagélen, továbbá ioncserélő gyantákon, pl. CM—Cephadex C—25, CM—Cellulose, Amberlite CG—50 vagy Dowex—50 kereskedelmi nevű ioncserélőkön nagymértékben és inaktiválódás nélkül adszorbeálódik, ugyanez az enzim azonban alumíniumoxidon, cellulóz-poron, DEAE-Cellulose vagy DEAECephadex—25 kereskedelmi nevű ioncserélőn vagy aniöncserélőkön egyáltalán nem adszorbeálódik, vagy az* adszorpció következtében az enzim elveszíti aktivitását. • Amikor az (I) általános képletű vegyületeket dezacilező enzimeket a hordozóanyagon adszorbeáltatjuk, előnyösen úgy járunk el, hogy a hordozóanyag hozzáadása előtt a szűrt fermentlé pH-ját a dezacilező enzim szempontjából stabilitást biztosító értékre állítjuk be. így "pl. ha a Bacillus megaterium törzs által termelt dezacilező enzimet celiten adszorbeáltatjuk, a hordozóanyag hozzáadása előtt a szűrt fermentlé pH-ját általában kb. 6 és 8 közötti értékre állítjuk. Abban az esetben, ha hordozóanyagként ioncserélőt vagy ioncserélő gyantát alkalmazunk, amelynek kapacitását a közeg ionerőssége hátrányosan befolyásolja, a pH növelésével általában fokozódik a dezacilező enzim adszorpcióképessége, illetve dezaktiválódásra való hajlama. Ezért a hordozóanyag megválasztásakor figyelembe kell venni, hogyan befolyásolja a közeg pH-ja a hordozóanyag sajátságait, és viszont. ; A dezacilező enzimet bármilyen szakaszos vagy folyamatos' módszerrel adszorbeáltathatjuk a hordozóanyagon. A felhasználandó hordozóanyag mennyisége a szűrt fermentlé enzimtartalmától és az enzimnek a hordozóanyaghoz viszonyított adszorpcióképességétől függően változik. Ha az enzimet szakaszos módszerrel adszorbeáltatjuk, a hordozóanyagot a szűrt fermentlé térfogatára sziámiivá általában kb. 5—15 vegyes % mennyiségben alkalmazzuk. A szakaszos adszorbeáltatás során a szűrt fermentléhez hordozóanyagot adunk, az elegyet összekeverjük, majd a hordozóanyagot elkülönítjük és vízzel mossuk. Az oszlop-módszer szerint a hordozóanyagot oszlopba töltjük, az oszlopot vízzel, vagy az enzimnek stabilitást biztosító pH-értékű pufferoldattal megnedvesítjük, a szűrt fermentlevet átbocsátjuk az oszlopon, majd az oszlopot vízzel mossuk. Ebben a műveletben adszorbeált enzimet tartalmazó hordozóanyag-oszlopot kapunk. . Ha az enzim-hordozóanyag adszorbátumot szárítjuk, az enzim inaktiválódhat. Ezért az (I) általános képletű vegyületek dezacilezésére célszerűen nedves (azaz nem szárított) hordozóanyag-enzim adszorbátumot használunk fel. A kiindulási anyagként felhasznált (I) általános képletű vegyületeket ismert módon állíthatjuk elő, pl. úgy, hogy valamely penicillin-szulfoxid-észtert gyűrűtágítási reakciónak vetünk alá (3 275 626 sz. USA-beli szaba-5 dalmi leírás, 68 06 532 sz. közzétett holland szabadalmi bejelentés, 1 204 394 sz. brit szabadalmi leírás, 696 026, 745 845,747 118,747 119 és 747 120 sz. belga szabadalmi leírások), és a kapott 7-fenilacetamido-3-metil-A3 -cefem-4-karbonsav-észter észter-csoportját lehasítjuk. Egy 10 másik ismert eljárás változat szerint az (I) általános képletű vegyületek előállítása során a 7-fenilacetamido-3--metil-A3-cefem-4-karbonsavakat dezacetoxidáljuk (3 275 626 sz. USA-beli szabadalmi leírás). Tekintettel arra, hogy az (I) általános képletű vegyületek enzimes 15 dezacilezését oldószeres közegben végezzük, az (I) általános képletű vegyületeket általában vízben oldódó alkálifémsóik, pl. kálium- vagy nátriumsóik formájában használjuk fél. Az (I) általános képletű vegyületek vizes oldatát hor-20 dozóra felvitt dezacilező enzimmel hozzuk érintkezésbe. Előnyösen úgy járunk el, hogy az enzimes reakció végrehajtása előtt a vizes oldatot az enzim hatása szempontjából optimális pH-értéket biztosító pufferoldattal pufferoljuk. Az enzimreakciót rendszerint oszlop-mód-25 szerrel hajtjuk végre, ebben az esetben ugyanis folyamatos üzemet biztosíthatunk. Az (I) általános képletű vegyület koncentrációja elsősorban az enzim dezacilező képességétől és az oldat áramlási sebességétől függően változik. Az (I) általános képletű vegyület koncentráció-30 ját úgy választjuk meg, hogy az effluensben reagálatlan (I) általános képletű vegyület számottevő mennyiségben ne legyen jelen. Az (I) általános képletű vegyületet rendszerint 0,1—2,0 vegyes %-os, előnyösen 0,5—1,0 vegyes %-os oldat formájában visszük fel az oszlopra. Az oldat 35 koncentrációját kisebb vagy nagyobb mértékben a hordozóanyag minősége is befolyásolja. Az enzimes reakciót az enzim működése szempontjából megfelelő hőmérsékleten és pH-értéken, rendszerint az optimális hőmérsékleten és pH-értéken hajtjuk végre. A reakció-40 körülmények megfelelő megválasztásával biztosítjuk, hogy az effluens a 7-ADCA-t a lehető legnagyobb koncentrációban tartalmazza. A reakcióidőt az (I) általános képletű vegyületet tartalmazó vizes oldat mennyiségének növelésével vagy csökkenésével összhangban változtatás juk. A reakció általában végetér, mielőtt az (I) általános képletű vegyület vizes oldata áthalad az oszlopba töltött enzim-hordozóanyag adszorbátumon. Ha az (I) általános képletű vegyület dezacilezése viszonylag kis sebességgel megy végbe, azaz az effluens még jelentős meny-50 nyiségű reagálatlan (I) általános képletű vegyületet tartalmaz, rendszerint úgy járunk el, hogy az effluenst ugyanazon az adszorbátum-oszlopon mégegyszer átbocsátjuk, vagy az effluenst egy másik hordozóanyaggal készített enzim-adszorbátum oszlopán bocsátjuk át, 55 ahol az (I) általános képletű vegyület dezacilezése nagy sebességgel megy végbe. Ha az enzimes reakciót folyamatos üzemben végezzük, az (I) általános képletű vegyület vizes oldatát folyamatosan juttatjuk a dezacilező enzim — hordozóanyag 60 adszorbátum oszlopára. Az (I) általános képletű vegyület dezacilezésének sebessége azonban baktérium-vándorlás és hasonló okok miatt napról napra fokozatosan csökkenhet. Ha az oszlop tetejére vagy a szubsztrátumra toluolt viszünk fel, a szennyezések káros hatása 65 minimálisra csökkenthető. *
