163453. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-amino-3-metil-delta3-cefem-4-karbonsav előállítására

9 163453 10 A találmány szerinti eljárásban egy enzim-hordozóanyag réteget több mint 10 napig használhatunk fel, ennek megfelelően a 7-ADCA-t nagy hozammal és kis költséggel állíthatjuk elő. A találmány szerinti, az (I) általános képletű vegyületek enzimes dezacilezésén alapuló eljárás tehát ipari és gazdaságossági szempontból rendkívül előnyös. A 7-ADCA-t ismert módon különíthetjük el a kapott oldatból. Az egyik módszer szerint a reakcióelegy pH-ját kb. 2-re állítjuk, az elegyet a reagálatlan (I) általános képletű vegyület eltávolítása érdekében hidrofób szerves oldószerrel, pl. etilacetáttal, butilacetáttal vagy metil-izobutil-ketonnal mossuk, a vizes fázist betöményítjük, majd pH-ját kb. 3,7-re állítjuk. Ezen a pH-értéken, amely az izoelektromos pontnak felel meg, a 7-ADCA kiválik a rendszerből. Egy másik módszer szerint a reakcióelegy pH-ját kb. 3,7-re állítjuk, az elegyet betöményítjük, lehűtjük, és a kapott csapadékot a reagálatlan (I) általános képletű vegyület és a karbonsav-melléktermékek eltávolítása érdekében acetonnal mossuk. A következőkben az adszorbeált enzim aktivitásának meghatározását ismertetjük. A hordozóanyag-enzim adszorbátumot L-alakú kémcsőbe töltjük, és lemérjük. A kémcsőbe 4,5 ml 0,1 mólos foszfátpuffer-oldatot (pH = 7,5) töltünk, és a kémcsövet 10 percig 37 °C-on egy Monod-típusú termosztált rázógépen rázzuk. Ezután a kémcsőbe 0,5 ml vizes 7-fenilacetamido-3-metil-A3

-cefem-4-karbonsav-nátriumsó-oldatot töltünk (szabad sav-tartalom: 10 mg/ml), és az elegyet 30 percig reagáltatjuk. A 30 perc elteltével a reakcióelegyet azonnal lehűtjük, a szilárd anyagot eltávolítjuk, és a folyadékfázis 7-ADCA-tartalmát TNBS módszerrel (trinitro-benzol-szulfonát) meghatározzuk. 100 egységnek tekintjük azt az enzim-mennyiséget, amely 100 y/ml 7-ADCA-t termel. A 7-ADCA meghatározását a következő módszerekkel végezzük: 1. módszer: A reakcióelegyet papírkorong- vagy lombik-módszerrel, Bacillus subtilis PCI—219 mikroorganizmus-törzszsel szemben vizsgáljuk. A tenyésztést 16 órán át 37 °C-on végezzük, majd meghatározzuk a köralakú inhibiciós (növekedésgátló) zóna átmérőjét. Az (I) általános képletű vegyület standard görbéjéből kiszámítjuk a reakcióelegyben jelenlevő (I) általános képletű vegyület menynyiségét, és a kapott értéket kivonjuk az (I) általános képletű vegyület kiindulási mennyiségéből. Az így kapott különbséget százzal szorozzuk, és osztjuk az (I) általános képletű vegyület kiindulási mennyiségével. A kapott százalékos érték az (I) általános képletű vegyület bomlási sebességére jellemző adat. 2. módszer: Meghatározott mennyiségű reakcióelegy pH-ját 1 n sósavoldattal 2,5-re állítjuk, az elegyet a térfogat felének megfelelő mennyiségű butilacetáttal háromszor mossuk, majd 1 n vizes nátriumhidroxid-oldáttal pH = 7,5-re lúgosítjuk. Az így kezelt elegy meghatározott mennyiségét a kiindulási (I) általános képletű vegyület oldalláncban levő savamid-csoportjának megfelelő savkloriddal reagáltatjuk, majd a kapott elegyet az 1. módszernél ismertetett vizsgálatnak vetjük alá. Kiszámítjuk az elegyben jelenlevő (I) általános képletű vegyület mennyiségét, majd meghatározzuk az annak megfelelő 7-ADCA mennyiséget. A 7-ADCA mennyiségét százzal szorozva és osztva a kiindulási (I) általános képletű vegyületnek 5 megfelelő 7-ADCA-mennyiséggel, megkapjuk a 7--ADCA hozamát. 3 módszer: TNBS-módszer (trinitro-benzol-szulfonát) 1 ml mintához 2 ml 0,3 mólos foszfátpuffer-oldatot 10 (pH =8,0) és 2 ml 0,1%-os TNBS-oldatot adunk, és a kapott elegyet sötét helyen 90 percig 50 °C-on tartjuk. A reakcióelegyet lehűtjük, 1 ml 6 n sósavoldatot adunk hozzá, és 395 mu, hullámhosszon meghatározzuk az oldat adszorpcióját. Az oldatban jelenlevő 7-ADCA 15 mennyiségét a 7-ADCA standard görbéje alapján számítjuk ki. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 20 1. példa Enzimkészítmény előállítása 30 literes üveg-fermentorba 1 % glukózt, 1 % polipep-25 tont, 1 % élesztőkivonatot és 0,5 % nátriumkloridot tartalmazó 20 liter folyékony táptalajt (pH = 7,0) töltünk, és a táptalajt 20 percig 120 cC-os gőzzel sterilizáljuk. Ezután a steril táptalajhoz steril körülmények között 200 ml Bacillus megaterium B—400 FERM—P No. 748 30 oltótenyészetet adunk (az oltótenyészet előállítása során a törzset 5 db 500 ml-es edényben levő 100 ml a fenti összetételű táptalajba oltjuk, 30 °C-on 24 órán át rázás közben tenyésztjük, majd a két legkedvezőbb növekedést mutató tenyészetet használjuk fel), és az elegyet 48 órán 35 át 30 °C-on, levegőztetés és keverés közben fermentáljuk. Az elegybe percenként 20 liter levegőt vezetünk, és az elegyet 300 fordulat/perc sebességgel keverjük. A fermentáció lezajlása után a sejteket Westfalia gyártmányú szeparátor-centrifugával eltávolítjuk. 17,4 liter 40 szűrt fermentlevet kapunk. 2. példa Az 1. példában kapott szűrt fermentlevet 30—35 °C 45 külső hőmérsékleten eredeti térfogatának 1/3-ára bepároljuk, és a koncentrátumhoz 80%-os telítettség eléréséig ammóniumszulfátot adunk. A kivált csapadékot desztillált vízben oldjuk, az oldatot Cephadex G—25 oszlopon sómentesítjük, és a sómentes oldatot fagyaszt-50 va szárítjuk. 24,3 g enzimkészítményt kapunk. 3. példa Enzimkészítmény előállítása 55 30 literes üveg fermentorba 0,5% glükózt, 0,3% glicerint, 1,0% húskivonatot és 1,0% polipeptont tartalmazó 20 liter folyékony táptalajt (pH =7,0) töltünk, és a táptalajt 20 percig 120 c

C-os gőzzel sterilizáljuk. 60 Ezután a táptalajhoz steril körülmények között 200 ml Bacillus megaterium B—400 FERM—P No. 748 oltótenyészetet adunk (az oltótenyészet előállítása során a törzset a fenti összetételnek megfelelő táptalajon 30 °C-on 24 órán át tenyésztjük), és az elegyet 72 órán át 65 30 °C-on, levegőztetés és keverés közben fermentáljuk. 5