163342. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12 vitamin fermentációs úton történő előállítására
163342 3 között zajlik le. Az anaerob körülmények a gázfejlődés közben biztosítva vannak, mert ekkor a gáz kiáramlása a levegő bejutást megakadályozza. Ekkor — mivel a gáztérben az oxigén parciális nyomása elenyésző — az oldatból is eltávozik az oxigén. 8—10 óra elteltével a gázképződés intenzitása erősen csökken, majd 16—18 óra múlva megszűnik, és így a periódus utolsó 6—8 órájában lassan megindul a levegő beáramlása a gáztérbe, a gáz felhígul, s így a fermentlé oxigéntartalma is növekedni kezd. Ezt követően a fermentlélevételnél a levegő beszívása és az oxigéntartalmú oldat azt követő adagolása miatt mind a gáztér, mind az oldat oxigénnel erősen szennyezetté válik. Az újra meginduló gáztermelés során egy-két óra szükséges ahhoz, hogy a folyadék oxigénmentessé váljék, és fölötte ismét metán-C02 atmoszféra alakuljon ki. A gáztér komponenseiben 24 órás periódusonként végbemenő szélsőséges koncentrációváltozásnak (vagyis az oxigén feldúsulásának, majd a metánkoncentráció csúcsértékig való növekedésének, végül az oxigénmennyiség újabb megnövekedésének) és az 02 tartalmú tápoldat adagolásának két következménye van: a) a fermentáció anaerobitása nem állandó, és így a B12 termelése is ingadozó; b) a keletkező gáz naponta meghatározott ideig robbanóképes, ezért az üzemmenet veszélyessége nagymértékben fokozódik. A találmány feladata olyan eljárás kidolgozása, amely a keletkező biogáz egyidejű hasznosítása mellett kiküszöböli a robbanásveszélyt és megszünteti a B12 termelés ingadozását. A találmány szerint úgy járunk el, hogy a fermentlé felett állandóan a fermentáció során keletkező gázkeverékből (biogázból) álló atmoszférát tartunk fenn azáltal, hogy a biogázt a fermentorokkal öszszeköttetésben álló gáztartályba vezetjük. A fermentlé szakaszos leeresztésekor a levett folyadéknak megfelelő térfogatú biogázt vezetünk vissza a gáztartályból a fermentorokba. Az eljárás további változataként a tápoldat szakaszos utántöltésekor a fermentorba légtelenített tápoldatot adaglolunk. Az említett intézkedésekkel a fermentáció anaerobitását állandó szinten tartjuk, ennek következtében a mikropopuláció szaporodása és a B12 termelés mintegy 10%-kal növekszik. Emellett a gáztartályban összegyűjtött biogázt elégetve biztosíthatjuk a táptalaj felmelegítéséhez és a fermentorok hőmérsékletszabályozásához szükséges gőzmennyiséget. A találmány szerinti eljárást az alábbi példa szemlélteti. 12 liter térfogatú fém-fermentorba, amelynek jól zárható fedelén gázelvezető, fermentlé-mintavevő, tápanyagbeadagoló csatlakozó vezeték és keverő van, 9 liter, üzemi fermentorból származó, virulens mikroorganizmusokat tartalmazó fermentlevet öntöttünk, és ehhez 1 liter 32°C-os vízben oldva az alábbi tápanyagokat adagoltuk: metanol 40 ml melasz 2g májextraktum 2 ml sörélesztő 5 g ammóniumhidroxid 1 ml 4 ammóniumhidrogénkarbonát 3 g nátriumbiszulfit 20 mg magnéziumklorid 0,1 g kobaltnitrát 10 mg o-xilidin 4 mg borostyánkősav 10 mg glicin 10 mg 5 g kukoricalekvárt összekevertünk 10 ml vízió zel, 1 mg 5,6-dimetilbenzimidazolt adtunk hozzá, és összekeverés után 15—20 percig melegítettük 50 °C-on, majd a felülúszót hozzáadtuk a táptalajkeverékhez. Ezután a táptalajkeverékkel intenzíven összekevertük az anyagot, majd a keverés leállítása 15 után a gázelvezető csövet összekötöttük a vízzárás gázharanggal. A fermentorokat és a hozzájuk tartozó gázharangokat 32 °C-ra temperált termosztátban helyeztük el. 24 óránként megmértük a keletkezett gázkeverék 20 mennyiségét, összetételét, a mintavevő csonkon keresztül levettünk 1 liter fermentlevet — miközben a gazométerből 1 liter gáz áramlott vissza a fermentlé helyére — és a fermentleben meghatároztuk a B12 vitamin tartalmat és a mikroorganizmusok számát. 25 A levett 1 liter fermentlé helyére a táptalaj beadadagoló nyíláson keresztül 1 liter fent leírt összetételű táptalaj keveréket adagoltunk be, összekevertük és a fermentációt további 24 órán keresztül folytattuk. A leírt műveletet huszonnégy órás perióduson-30 ként megismételtük, miközben a fermentlé állandóan saját gázatmoszférájával érintkezett, és naponta mértük a B12 vitamin, a mikroorganizmusok és a gáz mennyiségét, valamint a gázösszetételt. A mikroorganizmusok mennyiségének meghatározására 35 a fermentlé zavarosságát használtuk, amit elektrokoloriméterrel mértünk. A kapott extinkcióérték a mikroorganizmusok mennyiségével arányos. B12 vita- Gázmeny- Gázössze- A mikroorg. min nyiség tétel mennyiségre y/liter liter/24 óta CH4 CO a jellemző % % extinkció 45 I. hónap 9 200 19,2 79 21 39 II. hónap 10 200 20,1 78,5 21,5 40 III. hónap 11200 19,6 80,2 19,8 42 IV. hónap 11350 19,4 81 19 42,5 V. hónap 11040 20,0 80,5 19,5 42 VI. hónap 10 450 19,5 79,6 21,4 42,1 55 A B12 vitamin értékmérését papírkromatográfiás módszerrel, a gázmennyiséget gazométerrel, a gázösszetételt gázkromatográffal, a mikroorganizmusok számát denzitásméréssel végeztük. Az előbbi példában ismertetett módon eljárva ösz-60 szehasonlítottuk a találmány szerinti eljárást egy olyan eljárással, ahol a fermentor levegővel érintkezik. Hathónapos kísérleti idő alatt mértük a két fermentor B12 -szintjét. A papírkromatográfiás mérések eredményeinek havi átlagait a következő táblá-65 zatban közöljük: 2
