163335. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminális L-prolilcsoporttal szubsztituált inzulinok és származékaik előállítására
5 163335 6 mg termék oldódik 0,01 n sósavban és hidrogénkarbonátoldatban. Egy 6 n „ammóniamentes" sósavval hidrolizált mintában meghatározzuk az aminosavak mennyiségét, és a kapott eredményeket a csatolt táblázatban közöljük. 3. példa Di-[Nw -(N-terc-butiloxikarbonü-kprolU)]-inzulin 1,2 g (200 ixmól) sertésinzulint feloldunk 20 ml 1:1 arányú piridin-víz elegyben, az oldat pH-ját 0,25 n nátronlúggal 8,5-re állítjuk be, és hozzáadjuk 0,4 g (1,1 mmól) (N-terc-butiloxikarbonil-L-prolin)-p-nitrofenilészternek piridinnel készült oldatát. A keveréket szobahőmérsékleten keverjük, miközben a keverék pH-ját automatikusan 8,5 értéken tartjuk. A reakció időtartama 5 óra, ez alatt 6 egyenérték lúgot vesz fel a reakciókeverék. A réakciókeverék pH-ját 2,5 ml 6 n sósavval 5,5-re állítjuk be, majd szobahőmérsékleten vákuumban bepároljuk. A maradékot 10 ml vízzel mossuk, és az oldhatatlan anyagot szűrőn elválasztjuk. Ezt 10 ml vízben ismét szuszpendáljuk, és szűrőre visszük. Az oldhatatlan terméket 50 ml etanolban szuszpendáljuk, amikor az anyag előbb gyantás csomókká áll össze, majd ezek lassan megszilárdulnak a kolloid folyadék alatt. A folyadékot dekantáljuk, a szilárd maradékot 50 ml etilacetátban szuszpendáljuk, szűrőre visszük, és végül etilacetáttal mossuk. Vákuum-exszikkátorban megszárítva 828 mg terméket kapunk. Az alkoholos folyadékból további 75 mg nyerhető. A termék lassan oldódik 0,01 n sósavban, és jól oldódik híg alkáli hidrogénkarbonátoldatban. Egy minta hidrolizátumának kvantitatív aminosav elemzését a csatolt táblázatban közöljük. 4. példa Di-[N<o-(L-prolil)]-inzulin 500 mg 3. példa szerint készült védett di-[Nco-(L-prolil)]-inzulint 4 ml vízmentes trifluorecetsavban szuszpendálunk, mire az 20 perc alatt feloldódik. Az oldathoz 50 ml vízmentes étert adunk, és a képződött csapadékot 2 ízben 50 ml vízmentes éterrel kezeljük. A szilárd anyagot szűrőn elválasztjuk, és 10 ml vízben oldjuk. Az oldatból szűréssel eltávolítjuk az oldhatatlan anyagot, és a szüredék pH-ját trietilaminnal beállítjuk 5,5-re. Éjjelen át 5 & -oh állni hagyjuk, a csapadékot kicentrifugáljuk, és sorban 10 ml vízzel, 2 ízben 10-10 ml etanollal és végül 50 ml etilacetáttal mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. Az így kapott 400 mg termék oldható 0,01 n sósavban és híg hidrogénkarbonát-oldatban. Egy 6 n „ammóniamentes" sósavval 16 óra hosszat visszafolyatással forralt minta túdrolizátumában meghatározzuk az aminosavakat, és az eredményeket a csatolt táblázatban közöljük. A számok az aminosavegységek és az ammóniaegységek számát jelentik a molekulában. A fehérjék hidrolízisét és az aminosavak szétválasztását tárgyaló irodalmat összefoglalóan ismerteti Wieland [„Die Trennung und Bestimmung der natürlichen Aminosäuren", Fortschr. Chem. /, 211 (1949)]. Inzulinszármazékok aminosavösszetétele 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11 sa-3. Ja i Zj<t 4 II S!i II ip-6. Aszparaginsav 3 3 3 3 3 Treonin 2 2 2 2 2 Szerin 3 3 3 3 3 Glutaminsav 7 7 7 7 7 Prolin 1 2 2 3 3 Glicin 4 4 4 4 4 Alanin 2 2 2 2 2 Cisz tin 3 3 3 3 3 Valin 4 4 4 4 4 Izoleucin 2 2 2 2 2 Leucin 6 6 6 6 6 Tirozin 4 4 4 4 4 Fenilalanin 3 3 3 3 3 Hisztidin 2 2 2 2 2 Lizin 1 1 1 1 1 Arginin 1 1 1 1 1 Ammónia 6 6 6 6 6 5. példa Cink-Ncj-lrprolil-inzulin injekciós oldat Milliliterenként 80 egység inzulint tartalmazó 170 liter steril cink-Noj-Lprolil-inzulin-oldat előállítására a következőképpen járunk el: 125 liter injekcióra alkalmas vizet töltünk egy keverotartalyba. Hozzáadunk 2720 g glicerint, 170 ml 100%-os desztillált fenolt és 170 ml n sósavat, és az oldatot alaposan összekeverjük. 600 g cink-No-L-prolil-inzulint szuszpendálunk kb. 9 liter injekcióra alkalmas vízben. A keverékhez annyi n sósavat adunk, hogy a szilárd anyag feloldódjék és az oldat pH-ja 2,6-2,8 legyen. Az így kapott inzulinoldatot ezután beöntjük a keverotartalyba, és alaposan elkeverjük. Az oldatot injekcióra alkalmas víz hozzáadásával feltöltjük 165 kg-ra. Ezután n sósavval beállítjuk az oldat pH-ját 2,6-2,8-re, és injekcióra alkalmas vízzel feltöltjük 170 literre. Az oldatot rozsdamentes acél szűrőszöveten nyomás alatt átszűrve sterilizáljuk, és steril körülmények között 10 ml-es ampullákba töltjük. 6. példa Protamin-cink-Nco-L-prolil-inzulin 1000 liter protamin-cink-NorL-prolil-inzulin-oldat 65 előállítására a következőképpen járunk el: 3
