163335. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminális L-prolilcsoporttal szubsztituált inzulinok és származékaik előállítására
163335 tárnának további megnövelésére. így például a találmány szerinti Nw -prolilcsoporttal szubsztituált inzulinok reagáltathatok egy cinksóval, például cinkkloriddal, előnyösen puffer, például szerves sav (ecetsav, borostyánkősav vagy citromsav) és alkálifémhidroxid jelenlétében, amikor is cinkpropil inzulin keletkezik, vagy egy cinksóval és egy alkáliproteinnel, például protaminnal, hisztonnal vagy globinnal, amikor a termék protamin-, hiszton- vagy globin-prolilcinkinzulin. Az ilyen komplexek és készítmények előállítása jól ismert. Például a 2 787 575 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból ismeretesek olyan inzulin-fém komplexek, amelyek oldhatóságát a fémmel oldható komplexet alkotó vegyülettel, többek között glicinnel fokozzák. Ezektől a találmány szerinti eljárással készült vegyületek, illetve az azokból előállított cinkkomplexek abban különböznek, hogy az inzulin hatását L-prolilcsoportnak az inzulin terminális N-atomjára való kapcsolásával fokozzuk, és adott esetben az ilyen inzulinszármazékkal képzünk cinkkomplexet. Azonkívül az L-prolilinzulin izoelektromos pontjának a vér pH-értékére való növelése más módon, például alkalikus proteinnel való kapcsolással is elérhető. A találmány szerinti eljárással készült néhány termék hatástartamának és az ismert cinkinzulin hatástartamának összehasonlítására a következő kísérletet végeztük: Mintegy 300 m súlyú felnőtt hím patkányokból 5-10 állatból álló csoportokat alkottunk minden hatóanyag kipróbálására, és 40 kontroll patkánynak azonos térfogatú hatóanyagmentes oldatot adtunk. A próba előtti éjjel a patkányokat éheztettük, és a próba alatt sem tápláltuk. Közvetlenül kezelés előtt vérpróbát vettünk a patkányok farkából a glükóztartalom megállapítására. Nío-(N-terc-butiloxikarbonil-L^proliD-inzulint, N<o-(I L-prolil)-inzulint, di-N<o-(L-prolil)-inzulint és összehasonlításul 1 ismert cinkinzulint szuszpendáltunk vizes hordozóban, és a próba reggelén orális intubációval beadtunk minden állatnak 2 nemzetközi egység inzulinnak megfelelő mennyiséget. Vérpróbát vettünk kezelés után 1,3 és 5 órával, és meghatároztuk a glükóztartalmát. A kísérletek átlagolt eredményét a következő táblázatban foglaljuk össze: Vércukorcsökkenés, % Vegyület 1 3 5 óra múlva Kontroll 0 0 2 Cinkinzulin 45 20 0 No)-(L-prolil>inzulin (sertésinzulin) di-[Nco-(I^prolil)]-inzulir (sertésinzulin) Nw-(N-terc-butiloxikarbonil-L-prolil)-inzulin (sertésinzulin) 60 42 10 i " 54 26 7 33 11 10 A közölt adatokból kitűnik a terminális L-prolilcsoportot tartalmazó inzulinszármazékok hosszú hatástartama az ismert cinkinzulinhoz képest. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Ncj-(L-Prolil) inzulint tartalmazó parenterálisan alkalmazható készítmények előállítására az ismert inzulintartalmú készítmények számos ismert előállítási módszere felhasználható. Például a prolii inzulint feloldjuk 2-3 pH-nál (előnyösen 2,5-3,5 pH-nál) steril vízben. A kapott oldatban milliliterenként 40-500 egység L-prolil inzulin legyen. Előnyösen tartósítószert, például fenolt vagy m-krezolt adunk az oldathoz, célszerűen 0,05-0,5 s% arányban. Izotonikusság érdekében például glicerint is adhatunk hozzá, előnyösen 0,15 s% arányban. A találmány szerinti eljárással készült inzulinkészítményeket rendszerint szubkután injekció alakjában adjuk a cukorbajosoknak 0,25-2 ml, előnyösen 1 ml térfogatú adagokban, ami megfelel 20-1000, előnyösen 250 egység inzulinnak. Tudatában vagyunk természetesen, hogy a cukorbetegség kezelésében nincs normális adag, és a mindenkori adagot egyénileg kell megállapítani az illető beteg szükséglete szerint. 1. példa N(o-(N-terc-Butiloxikarbonil-L-prolil>inzulin 1,2 g (200 /imól) sertésinzulint feloldunk 20 ml 1:1 arányú piridin-víz elegyben, és az oldathoz hozzáadjuk 0,2 g (600 jumól) (2 ml) (N-terc-butiloxikarbonil-I^prolin)-p-nitrofenilészternek piridinnel készült oldatát. A reakciókeveréket szobahőmérsékleten keverjük, a pH értékét állandóan automatikusan 8,5-ön tartva. A reakciókeverék 2 óra alatt 2,5 egyenérték 0,25 n nátriumhidroxid oldatot fogyaszt, ezután a lúgfogyasztás megszűnik. A keverék pH-ját 2 ml 6 n sósavval beállítjuk 5,5-re, és vákuumban bepároljuk. Az olajos maradékot 20 ml 5,5 pH-ra beállított vízben oldjuk, és az oldatot vákuumban ismét beparoljuk. A száraz maradékot 50 ml etanolban szuszpendáljuk, és a kolloidoldatot dekantáljuk az üledékről. A terméket 50 ml etilacetátban szuszpendáljuk, szűrőre visszük, etüacetáttal mossuk, és exszikkátorban szárítjuk. Az így kapott 1,0 g termék oldható híg nátriumhidrogénkarbonát-oldatban. A termék egy mintáját 6 n „ammóniamentes" sósavban hidrolizáljuk, és a hidrolizátum aminosavtartalmát kvantitative meghatározzuk. Az eredményeket a csatolt táblázatban közöljük. 2. példa Ncj-(L-Prolil)-inzulin 500 mg 1. példa szerint készült terméket 4 ml trifluorecetsavban szuszpendálunk, és 20 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, miközben feloldódik. Az oldathoz 50 ml vízmentes étert adunk, az oldhatatlan csapadékot két ízben 50 rrü vízmentes éterrel kezeljük, majd szűrőre visszük. A szűrőn maradt anyagot 10 ni vízben oldjuk, és az oldatból kiszűrjük az oldhatatlan anyagot. A 2 pH értékű szüredéket dietilaminnal 5,5 pH-ra állítjuk be, és éjjelen át 5 C°-on állni hagyjuk. A csapadékot centrifugáljuk, és sorban 10 ml vízzel, 2 ízben 10 ml etanollal és végül 50 ml etilacetáttal mossuk, szűrőre visszük, és vákuumban szobahőmérsékleten szárítjuk. A kapott 380 2
