162857. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, lassú hatású alfa- és béta-glükopropteidek előállítására mikróba-tartalmú oldatokból vagy szuszpenziókból
162857 11 12 A táptalaj előállítása Húskivonat 5 g Nátriumklorid 5 g Kazein pepton 5 g Élesztő autolizátum 5 g Bikálium-hidrofoszfát 3,5 g Monokálium-diíhidrofoszfát 1,5 g Glükóz 10 g Fiton (pepton fajta, 1. Balti-more Biological Lab. katalógusát) 20 g Desztillált víz feltöltve 1000 cm3 -ig A közeg pH-ját 7,4—7,6-ra állítjuk be. A táptalajt a glükóz és a fiton hozzáadása előtt 20 percen keresztül forrón sterilizáljuk, lehűtjük, beoltjuk és ezután keverjük hozzá a glükóz és a fiton-oldatokat. A Klebsiella-kultúra kitenyésztése végett 10 cm3 húsleveshez üveggolyócskákat adunk és a zselatinálódott közegbe oltjuk be a Klebsiellá-t. Amint a táptalaj elfolyósodott, még 50 ml húslevest keverünk hozzá. Ez a kultúra szolgált törzstenyészetként, melyet egy szifon^csövön keresztül keverünk az 1 literes táptalajba. A táptalaj pH-ját 7,4 és 7,6 között tartjuk, a hőmérsékletét pedig pontosan 37 C°-on. Elővigyázatosságból a táptalajhoz még gombaölőszert is adunk. A táptalaj keverési sebességét és a levegő adagolását úgy állítjuk be, hogy az legjobban elősegítse a kultúra fejlődését. A csírák növekedését fotometrikus úton követjük: az oldat optikai sűrűségét összehasonlítjuk egy etalon-oldat görbéjével és ennek alapján állapítjuk meg a csírák számát. A tenyésztés ideje kb. 7 óra. A teljesen kifejlődött tenyészetben cm3 -ként kb. 120 milliárd csíra van. A csírák feloldása A kifejlődött tenyészet minden ml-éhez 80 y lizozim-klórhidrátot adunk, melyet előzőleg pár ml steril sós vízben hígítottunk fel. A táptalajt 56 C°-ra melegítjük és ezen a hőmérsékleten tartjuk 1 óra hosszat, majd az oldat sterilitását ellenőrizzük. A steril oldathoz 2,5%-os. etilmerkuri-tioszalicilát nátriumsó-oldatot adunk és 33%-os polietilénglikol-szorbát oldatot, melynek kereskedelmi neve Tween 80. Az így beállított oldóenzimes oldatot 40 C° hőmérsékleten tartjuk 8—15 napon keresztül, steril körülmények között. Extrahálás , A csírák feloldásánál keletkező oldatot forgó vákuumbepárló készüléken koncentráljuk vagy liofilizáljuk, oníg az oldat térfogata az eredeti térfogat egyharmadára nem csökken. Az így ka_pott nyers termék sötétszínű és konzisztenciája sűrűn folyó. Kívánt esetben a fel nem oldódott mikrobamaradványokat centrifugálással elválaszthatjuk még a koncentrálás előtt. Ilyen esetben a koncentrálást csak az üledék feletti tiszta oldattal végezzük. 5 Lipoidmentesítés A koncentrált sűrű oldatot szuszpendáljuk ötszörös térfogatú keverékkel, mely 1 térfogatrész metanolból és 4 térfogatrész acetaldehid-10 bői áll. A keveréket szobahőmérsékleten erős keverés közben adjuk a sűrítményhez. Fokozatosan kiválik egy sűrű összeálló csapadék, mely erősen színezett. A csapadék felett 15 levő oldat színe is barnás. A csapadékot 15 percig ülepedni hagyjuk, ezután a felette levő folyékony fázis nagy részét gondosan leöntjük. .Az üledéket átvisszük egy nuccsszűrőre és erő-20 sen leszívatjuk. A leszűrt anyagot 5—5 térfogat acetonnal kétszer mossuk. A leszűrt anyagot ezután a szuszpendálásához szükséges minimális térfogatú acetonnal szuszpendáljuk és átvisszük egy extrakciós hüvelybe, melyet egy 25 folytonos extraháló készülékbe helyezünk. A hüvelybe helyezett anyagot 3 napon keresztül acetonnal extraháljuk. Extrahálás végén a fűtést leállítjuk, az extraháló hüvelyt a ké-30 szülékből kivesszük és a szilárd maradékot elkülönítjük. A tisztítási folyamat e stádiumában a glükoproteid-frakció világos vagy sötétbarna színű többé-kevésbé összeállt por. A lipoidmentes glükoproteid-frakcióhoz négyszeres súlyú vizet adunk és így oldatba viszszük, az- oldatot lehűtjük 4 C°-ra és jégszek-40 rényben tartjuk 3 napon keresztül. Sárszerű massza keletkezik, melyben a nemoldódó rész főként denaturált protein-vegyületekből, kristályos ásványi sókból és főként alkálifoszfát kristályokból áll. 45 A keveréket szűrőpapíron vagy gézen leszűrjük, hogy a szilárd frakció nagy részét elválasszuk. A szűredéket ezután centrifugáljuk. A glükoproteidek lecsapása 50 Az előzőekben kapott tiszta szűredékhez 5 térfogat keveréket adunk, mely 1 térfogatrész metanolból és 4 térfogatrész acetaldehidből áll. A keverék hozzáadását 1 óra alatt erős keverés 55 közben végezzük. Sárga, homokszerű csapadék válik ki, melyet leszűrünk, gyorsan acetonnal kimosunk és légritkított térben foszforpentoxid felett szárítjuk 24—48 órán át. 60 Amint az anyag többé-kevésbé megszáradt, összedaráljuk és tovább szárítjuk 45 C° hőmérsékleten 3—4 napon keresztül. Ily módon 1 liter tiszta tenyészetből 6—12 g halványsárga színű glükoproteid-frakciót ka-65 punk. 20 25 35 Fehérjementesítés 40 45 6
