162212. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és diagnosztikai szer glukóz enzimes meghatározására
3 162212 4 ben. Az eddig ismert ilyen oldatok ATP-tartalma hosszabb tárolás folyamán csökkent és az ilyen mérőoldatok felhasználása téves eredményhez vezetett. Ä találmányunk szerinti eljárással előállított vegyszer-keveréket száraz formában is tárolhatjuk, mint homogén por-keveréket. Az ilyen porkeverékek lezárt üvegekben, levegő és nedvesség hatásától megóva, szobahőmérsékleten is jól tárolhatók és szállíthatók. Nem várt módon azt találtuk, hogy az azidok jelenléte nem zavarja az enzimatikus reakciókat. A találmányunk szerinti eljárásnál gyakran felületaktív anyagok használata is előnyös, pl. etilénoxid adduktok használata (ilyen a Monsanto cég által előállított digitonin vagy szerox). A találmányunk további tárgya még a glukóz enzimatikus meghatározására szolgáló diagnosztikai szer, mely hexokinázból, glukóz-6-foszfátdehidrogenázból, adenozintrifoszfátból, magnéziumszulfátból, nikotinamid-adenin-dihukleotidfoszfátból (NADP) és egy azid-tartalmú pufferból áll. A találmányunk szerinti diagnosztikai szer célszerűen egy homogén porkeverék és egy oldat formájában hozható forgalomba. A porkeverék adenozin-trifoszfátot, magnéziumfoszfátot, nikotinamid-adenin-dinukleotidfoszfátot, tompító anyagokat, digitunint és azid-vegyületet tartalmaz. Az enzimek, a hexokináz és a glukóz-6-foszfát dehidrogenáz pedig külön egy ammónszulfát oldatban vannak szuszpendálva. A pufferoló anyag trietanolamin-hidroklorid és nátriumhidroxid, illetve nátriumkarbonát keveréke, az esetben, ha az azid nátriumsó formájában van jelen. Megfelelő pufferoló anjp/ag még pl. a tris-hidroximetilaminometán (borostyánkősav, illetve az imidazol) borostyánkősav. A pufferek pH-ja 6.8 és 7.5 között van. Azid-vegyületként felhasználhatók az alkáli-azidok és a földalkáli-azidok, pl. a nátriumazid, káliumazid. lítiumazid, magnéziumazid, kálciumazid és az ammóniumazid. A találmányunk szerinti diagnosztikai szer egy másik kiviteli formájánál az adenozintrifoszfát, magnéziumfoszfát, a pufferkeverék, a digitonin és az azid vizes oldat formájában van jelen, a nikotinamid-adenin-dinukleotidfoszfát szilárd formában (pl. tablettákba préselve) és a hexokináz és glukóz-6-foszfát dehidrogenizált enzimek pedig ammónszulfát-oldatban való szuszpenzió formájában. A találmányunk szerinti diagnosztikai szer összetétele, előnyösen a következő: 1 —15 • s% MgSCV7H2 0 0,5 — 6 s% NADP 0,5 — 6 s% ATP 2,0 —18 s% Nátriumazid 0,10— 1,5 s% Digitonin 50 —95 s% Puffer-keverék és a megfelelő enzim-szuszpenzió. A puffer-keverék összetétele előnyösen: 1,56—11,0 s% trietanolamid-hidroklorid 0,6 — 3,5 s% Na2 C0 3 , illetve 5 1,2 — 7,5 s% trisz-hidroximetilamino-metán 0,55— 3,45 s% borostyánkősav, illetve 0,7 — 4,5 s% imidazol és 0,70— 1.75 s% borostyánkősav. 10 A találmányunk szerinti diagnosztikai szer felhasználásánál a glukóz- meghatározása a következőképpen történik: Ha a diagnosztikai szer porkeverék formájában fordul elő, használat előtt megfelelő meny-15 nyiséget desztillált vízben feloldunk. A fel nem hasznát részt kívánt esetben hetekig tárolhatjuk hűtőszekrényben minőségromlás nélkül. Az oldathoz hozzáadjuk szokásos módon a glukóztartalmú anyagot (pl. vért), mérjük az extink-20 ciót, ezután hozzáadjuk a hexokináz (glukóz-6--foszfát-dehidrogenázból álló enzimkeveréket és , az extinkciót újra mérjük. Az enzimkeverék, különösen hideg helyen éveken át tárolható minden különösebb óvatossági rendszabály nél-25 kül. A találmányunk szerinti eljárás és a találmányunk szerinti diagnosztikai szer tehát lehetővé teszi a glukóz-meghatározásnak igen egyszerű módon való elvégzését, kiküszöböli azt, hogy az egyes vegyszereket külön kelljen be-30 pipettázni, megmérni és állandóan új oldatokat készíteni. Az adenozintrifoszfát vizes oldatainak találmányunk szerinti eljárással elérhető rendkívüli stabilitását a következőkben ismertetendő ösz-35 szehasonlító kísérletek is igazolják. E kísérletek során vizes oldatokat használtunk, amelyek a találmányunk szerinti diagnosztizáló szert tartalmazzák, tehát adenozintrifoszfátot, dinátriumsója formájában, magnéziumszulfátot, trietanol-40 amin-hidrokloridot, nátriumkarbonátot, digitonint és nátriumazidot, az összehasonlító-oldatok pedig ugyanezen vegyületeket tartalmazzák, de nátriumazid nélkül. Az összehasonlító kísérletek a következő eredményeket adták: ATP-konc. ATP. mg/ml csökkenése Időtartam %-ban azid- azid azid- azid dal nélkül dal nélkül Induló érték 10 nap után 0,425 0,450 0 0 55 20 nap után 0,420 0,170 —1,2. —62 50 nap után 0,418 0,040 —1,6 — 91 90 nap után 0,390 0,000 —8 —100 A táblázatban megadott eredmények jól mu-60 tatják a találmányunk szerinti diagnosztikai szer kiváló tulajdonságait. A találmányunk szerinti eljárással a glukóz meghatározás igen egyszerűen kivitelezhető. Fe-65 leslegessé vált az eddig alkalmazott gyakori pi-2
