162212. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és diagnosztikai szer glukóz enzimes meghatározására
5 162212 6 pettázás és az oldatok frissen való elkészítése. A vegyszer-oldatok jól tárolhatóak és ennélfogva a vegyszer-szükséglet lényegesen lecsökkenhet. A találmányunk szerinti eljárás felhasználását a következő példákon mutatjuk be. 1. példa: Homogén porkeveréket készítünk, mely a következőkből áll: 11,0 g trietanolamin-hidroklorid 3,5 g nátriumkarbonát 0,2 g magnéziumszulfát-heptahidrát 0,1 g nikotinamid-adenin-dinukleotidfoszfát 0,1 g adenozin-5'-trifoszfát dinátriumsója, trihidrát 0,3 g nátriumazid 0,02 g digitonin A porkeverékből 150 mg-ot bemérünk légmentesen lezárható üvegbe. Használat előtt a bemért anyaghoz 2 ml vizet adunk, rázogatjuk míg oldatba megy, majd hozzáadunk 0,005—0,2 ml vizsgálandó anyagot, pl. vért, vizeletet, szérumot stb. 366, illetve 340 nm-re beállított fotométerrel meghatározzuk a kezdeti extinkciót Eo-t. Ezután hozzáadunk az enzimkeveréket tartalmazó szuszpenzióból egy cseppet. Az enzimszuszpenzió 3 mólos ammóniumszulfát-oldat, amely ml-ként 150 egység hexokinázt és 75 egység glukóz-6-foszfát-dehidrogenázt tartalmaz. Várunk 5—10 percig, míg beáll a konstans extinkció érték E( . Azextinkció értékek különbsége E = Ej—Eo szorozva a megfelelő átszámítási tényezővel, közvetlenül megadja a vizsgálandó anyag glukóz-tartalmát. A fel nem használt oldatok hónapokon át tárolhatók és a leírt módon bármikor újra felhasználhatók. A digitonin-tartalmú vegyszerkeverék felhasználása lehetővé teszi azt, hogy a vért közvetlenül a vizsgálóoldatba adjuk be. Nincs tehát szükség arra, hogy az optikai mérést egyébként zavaró vörösvérsejteket eltávolítsuk és a fehérjéket lecsapjuk. Ennélfogva egy méréshez 0,005—0,01 ml vér is elelgendő. 2. példa: Egy mérőküvettába bepipettázunk 2,5 ml oldatot melynek összetétele a következő: 0,140 g trietanolamin-hidroklorid 0,020 g adenozin-5'-trifoszfát 0,003 g magnéziumszulfát-heptahidrát 0,016 g nátriumkarbonát 0,0025 g nátriumazid 0,00025 g digitonin A bemért oldatban feloldunk egy tabletta NADP-t és hozzáadunk 0,01 ml vért. A digitonin hatására a bemért vér hemolizise azonnal bekövetkezik. Ezután az 1. példában leírt'módon járunk el, leolvassuk a kezdeti extinkciót, Eo-t, hozzáadjuk az enzimkeveréket és leolvassuk a végső extinkciót Ej-t. Ä mérések és az ered-5 meny kiértékelése ugyanúgy történik, mint az 1. példában. Szabadalmi igénypontok: 10 1. Eljárás a glükóz enzimes meghatározására, melynél a glükózt adenozintrifoszfáttal és hexokinázzal glükóz-6-foszfáttá alakítjuk át, ezt glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz jelenlétében nikotin-15 amid-adenin-dinukleotidfoszfáttal glükonát-6--foszfáttá oxidáljuk és az így keletkező redukált nikotinamid-adenin-dinukleotidfoszfátot spektrofotometrikus módszerrel meghatározzuk, azzal jellemezve, hogy a meghatározást azid ve-20 gyületet tartalmazó, előnyösen trietanolamin-hidroklorid és nátriumhidroxid vagy nátriumkarbonát keverékéből álló, 6,8—7,5 pH-értékű puffer jelenlétében végezzük. 2. Diagnosztikai szer glükóz enzimes megha-25 tarozására — mely szer hexokinázból, glükóz-6--foszfát-dehidrogenázból, adenozintriíoszfátból, magnéziumszulfátból, nikotinamid-adenin-dinukleotidfoszfátból, egy pufferből és adott esetben valamely felületaktív anyagból áll, — azzal 30 jellemezve, hogy a puffer azidvegyületet tartalmaz. 3. A 2. igénypont szerinti diagnosztikai szer kiviteli változata, azzal jellemezve, hogy ez a szer az adenozintrifoszfátot, a magnéziumszul-35 fátot, a nikotinamid-adenin-dinukleotidifoszfátot, a pufferanyagot és az azid-vegyületet homogénporkeverék alakjában tartalmazza és a hexokináz, valamint a glükóz-6-foszfátdehidrogenáz enzimek ammóniumszulfát-oldatban külön 40 szuszpenziót alkotnak. 4. A 2. vagy 3.,igénypont szeriinti diagnosztikai szer kiviteli változata, azzal jellemezve, hogy a pufferanyag trietanolamin-hidrokloridból valamint nátriumhidroxidból, vagy nátriumkarbo-45 nátból és nátriumazidból áll. 5. A 2. vagy 4. igénypont szerinti diagnosztikai szer kiviteli változata, azzal jellemezve, hogy az adenozintrifoszfát, a magnéziumszulfát, a pufferkeverék, a digitonin és a nátriumazid 50 vizes oldat, a nikotmaimid-adenin-dinukleotidfoszfát szilárd halmazállapotú por és a hexokináz valamint a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz enzimek ammóniumszulfát-oldatban külön szuszpenzió alakjában vannak jelen. 55 6. A 2—5. igénypontok bármelyike szerinti diagnosztikai szer kiviteli változata, azzal jellemezve, hogy a szer 1 —15 súlyszázalék magnéziumszulfátot, 60 0,5 — 6 súlyszázalék nikotin'amidr-adenin-dinukleotidfoszfátot, 0,5 — 6 súlyszázalék adenozintrifoszfátot, 2,0 —18 súlyszázalék nátriumazidot, 0,10— 1,5 súlyszázalék digitonint, 65 50 —95 súlyszázalék pufferkeveréket 3
