162171. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a szérum kalciumtartalom csökkentésére képes hormonszerű szer előállítására

13 162171 14 tük azzal a folyékony kivonattal, amelyből előzőleg a szilárd anyagokat centrifugáltuk. 1,71a fenti módon kapott folyékony kivonathoz 250ml45%-os triklórecetsavat elegyítettünk, majd 15 percen át percenként 9000 fordulattal centrifugáltuk a csapadékossá vált folyadékot. Az igy elkülönített csapadékot 50 ml vízben (pH=6,5) diszpergáltuk, és az oldhatatlan anyagokat 10 percen át percenként 5000 fordulattal való centrifugálással távolitottuk el. A csapadék feletti folyadékot liofilizáltuk, 450 mg nyers, hormonszerü hatóanyagot kaptunk, melynek hatáserőssége 1,8 MRC E/mg. 4. példa: Kb. 3000 angolnából (Anguilla japaiiica) kivettük a vena cava a szívhez közeli, a nyelőcső falához kötődött részét, továbbá a szivburokhártyát. Ezt a nyersanyagot a3. példában leirt módon zsírtalanítottuk és víztelenítettük, és igy 255 g poralaku nyersterméket kaptunk. 225 g fenti poralaku terméket 960 g karbamid és 35 g cisztin 2 1 0,2 n sósavval készített oldatával 2 órán át extraháltuk szobahőmérsékleten, keveréssel. Ezután ebbe az extrakciős folyadékba beadagoltunk ecetsav és aceton 1:1 arányú elegyéből 4 litert,majd 56 ml 1 mólos, vizes konyhasóoldat és 6 í aceton elegyének 6 l-es részletét adtuk hozzá, és a keveréket alaposan megkevertük. A fehérje-csapadékot 15 percen át percenként 9000 fordulattal való centrifugálással eltávolítottuk. A csapadéktól elkülönített folyadékhoz 10 ml peroxidmentes étert elegyítettünk, az elegyet alaposan megkevertük, ekkor kis molekulasúlyú fehérjékből álló csapadékot kaptunk, mely magában foglalja a kívánt hatóanyagot. Ezt a csapadékot 15 perben át percenként 9000 fordulattal való centrifugálással elkülönítettük. A csapadékot ezután kétszer mostuk 500 ml 1:1 arányú éter-acetonelegygyel, majd liofilizáltuk, és 17,-8 g poralaku nyers termék formájában kaptuk a kivánt hatóanyagot, melynek hatáserőssége 1,0 E/mg, 5. példa: 700 mg a 4. példában leirt módon kapott terméket80mll2:3:5 arányú butanol-ecetsav-viz-elegyben homogenizáltuk és 2 órán át keverés közben extraháltuk. Ezután afelüluszó folyadékhoz - melyből az oldhatatlan anyagokat 10 percen át percenként 3000 fordulattal való centrifugálással eltávolítottuk - 24 ml butanolt, 28 ml vizet és 3 ml piridint elegyítettünk, az elegyet kevertük, majd állni hagytuk, mig két fázisra vált szét. Elkülönítettük a butanolos felső fázist, amely az izolálandó hatóanyag zömét tartalmazta. Az alsó fázishoz hozzáadtunk 80 ml-t a 6:1:9:0,25 arányúbutanol:ecetsav: ;viz:piridin elegy felső fázisából, a kapott elegyet kevertük, majd állni hagytuk. Elkülönítettük a lényegében butanolos réteget. Ezt a réteget a továbbiakban 3-szor egymás után a fenti módon kezeltük. Az igy kapott felső fázisokat egyesitettük, majd csökkentett nyomáson betöményitettük. A betöményitett maradékot éterrel mostuk és 4 ml 0,2 mólos ammőniumaeetátoldatban (pH = 4,7) feloldottuk. Az oldatot átfolyattuk 0,2 mólos ammóniumacetátoldattal (pH = 4,7) pufferolt, 2,0 cm 80 cm-es "Sephadex G-75" oszlopon, és az említett pufferoldattal óránként 12 ml-es átfolyási sebességgel eluáltuk. Az eluátumot 4 ml-es frakciónként fogtuk fel. Az egyes frakciók biológiai értékmérését patkányon végeztük, és azt találtuk, hogy az izolálandó hatóanyagot az eluátum a 63-tól a 82. frakciójáig terjedő része tartalmazta. Ezeket a frakciókat egyesitettük és csökkentett nyomáson betöményitettük, majd liofilizáltuk, és igy 2,1 mg poralaku termék formájában kaptuk a kivánt hatóanyagot, melynek hatáserőssége 24 E/mg. 6. példa: Kb. 3000 angolnából (Anguilla japonica) a myocardium eltávolítása után 350 g szivburokhártyát kaptunk. Elvégeztük a 3. példában leirt módon a víztelenítést és a zsirtalanitást, és igy a szivburokhártyából 105 g szárított terméket kaptunk. Ezt a 105 g szárított terméket az 1. példában leirt módon kezeltük, azonbanugy, hogy a triklóreeetsavas kezelés után kapott csapadékot 15 percen át percenként 9000 fordulattal való centrifugálással elkülönítettük, és igy 700 mg csapadékot kaptunk. Ezt a csapadékot 100 ml éterrel mostuk, majd feloldottuk 28 ml vizben, és az oldhatatlan anyagok 10 percen át percenként 500 fordulattal való centrifugálása után liofilizáltuk a vizes oldatot; 350 mg poralaku nyers termék formájában kaptuk a hormonszerü hatóanyagot, melynek hatáserőssége 8 MRC E/mg. 7. példa: 40 350 mg a 6. példában leirt módon kapott poralaku nyers terméket feloldottunk 3 ml 0,2 mólos ' ammóniumacetát-oldatban (pH = 4,7). Az oldatot feltöltöttük 3,0 cm x 100 cm-es "Sephadex G-75" 45 oszlopra és 0,2 mólos ammóniumacetát-oldattal (pH =4,7) óránként 9 ml-es átfolyási sebességgel eluáltuk. Az eluátumot 4,5 ml-es frakciónként fogtuk fel. Az összes frakciók biológiai értékmérése alapján megállapítottuk, hogy a szérum-kalcium-50 tartalmat csökkenteni képes hormonszerü hatóanyagot az eluátum az 50-től a 60. frakciójáig, terjedő része tartalmazta. Ezeket a frakciókat egyesitettük. Az egyesitett frakciókat csökkentett nyomáson betöményitettük, majd liofilizáltuk, és 55 igy 45 mg poralaku nyers terméket kaptunk. Ezt a 45 mg poralaku terméket feloldottuk 1 ml 0,01 mólos ammóniumformiát-oldatban (pH = 4,37). Az oldatot feltöltöttük 1,0 cm x 5,0 cm-es karboximetilcellulóz-oszlopra (CMC-oszlopra), majd óráng0 ként 4,5 ml-es átfolyási sebességgeleluáltukakövetkező sorrendben az alábbi eluáló oldószerekkel: 70 ml 0,01 mólos ammóniumformiát-oldat (pH = = 4,37); 60 ml 0,01-0, 02 mólos ammóniumformiátoldat, 30 ml 0,2 mólos ammóniumformiát-oldat. 65 Az eluátomot 2 ml-es frakciónként fogtuk fel. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7