162171. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a szérum kalciumtartalom csökkentésére képes hormonszerű szer előállítására

162171 11 12 A Sephadex-készitmények közé tartoznak pl. a G25, G50, G75 és G100 jelzésűek; a Biogel készítmények közé tartoznak pl. a P-2, P-4, P-6, P-10, CM-2 és a CM-30 jelzésűek; az ioncserélő-Sephadex készítmények közé tartozik pl. a CM-Sephadex és az SE-Sephadex; az ioncserélő cellulózok közé tartozik pl. a CM-cellulóz és a DEAE cellulóz. Az emiitett fehérjék eltávolítása után a kapott oldat sókat tartalmaz, ezért rendszerint ioncserélőgyantákkal vagy valamely más szokásos módszerrel sómentesitjük. A fenti eljárással kapott anyagot tovább tisztithatjuk gélfiltrációs, elektroforézises, ellenáramú megosztásos, vékonyrétegkromatográfiás stb. módszerek segítségével. A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 1. példa: Kb. 2000 angolnából (Anguilla japonica) kapott 505 g szövetet, — mely magába foglalja a vena cava a szivhez közeli, a nyelőcső falához kötődő szakaszát - ugy vizmentesitettünk, hogy egymásután háromszor elvégeztük a következő müveletet: a fenti szövetet 90 mg EDTA-t tartalmazó 3 1 acetonban áztattuk 5 órán át 5 C°-on. A vizmentesitett szövetet 2 15 C°-os kloroformban áztattuk 2 órán át, és ezt a müveletet még 2-szer megismételtük. Ezután 3-szor egymás után újra elvégeztük a fenti vizmentesitési müve letet, azonban ugy, hogy 2-2 1 acetont alkalmaztunk. A kapott csapadékot levegőn száritottuk és 110 g terméket kaptunk. A kapott 110 g száritott terméket 480 g karbamid és 17,5 g cisztin 0,2 n sósavval készített oldatában szobahőmérsékleten 2 órán át való áztatással extraháltuk. A kapott folyékony kivonathoz 2 1 1:1 arányú aceton-ecetsav-elegyet adtunk, majd 28 ml vizes 1 mólos konyhasóoldat és 3 1 aceton elegyét adtuk hozzá. A kicsapódott fehérjéket 15 percen át centrifugáltuk (percenként 9000 fordulattal) . A tiszta szupernatáns folyadékhoz 170 ml 45%os triklórecetsavat elegyítettünk, az így kapott folyadék 7,5 % triklórecetsavat tartalmazott, és az elkülönítendő hatóanyag kicsapódott. A csapadékot 15 percen át (percenként 9000 fordulattal) való centrifugálással elkülönítettük, 200 ml éterrel mostuk, majd 500 ml 0,02 n sósavban feloldottuk. Az elkülöníteni kivánt hatóanyagot tartalmazó sósavas oldatot 2 cmx30 cm "Amberlite IRA 400" ioncserélőoszlopra töltöttük és óránként 150 ml-es átfolyási sebességet állítottunk be, az oldatban levő különböző sókat az ioncserélőoszlop abszorbeálta. Végül 50 ml desztillált vizzel eluáltuk az oszlopból az elkülöníteni kivánt hatóanyagot. Az eluátumot betöményitettük majd liofilizáltuk, és 800 mg poralaku nyerstermékként kaptuk a szérum-kalciumtartalmat csökkenteni képes hormonszerü anyagot. 2. példa: 1,0 g az 1. példa szerinti eljárással kapott nyers, poralaku, a szérum-kalciumtartalmat csök-5 kenteni képes hormonszerü anyagot, (melynek hatáserőssége 6,5 E/mg), a 60:15:25 arányú butanol: : ecetsav:viz oldószerelegy 100 ml-es részletében diszpergáltunk, és az extrakció elősegítése céljából 4 C°-on 1 órán át kevertük az elegyet. Ezután 10 az extrakciós elegybe bemértünk 30 ml butanolt, 110 ml vizet és 3,75 ml piridint, az így kapott elegyet kevertük, majd vártunk, mig két fázisra oszlott. Elkülönítettük az alsó fázistól a butanolos felső fázist, mely az izolálandó hatóanyag zömét magá-15 ba foglalta. Az alsó fázishoz hozzáadtuk a 6:1:9: : 0,25 arányú butanol: ecetsav: víz: piridin oldószerelegy felső fázisának 100 ml-es részletét, az elegyet kevertük, majd állni hagytuk. A butanolos felső fázist elkülönítettük. Az alsó fázissal 3-szor meg-20 ismételtük a fenti müveletet. Az így kapott felső fázisokat egyesitettük és csökkentett nyomáson bepároltuk. A besűrített terméket éterrel mostuk, majd 25 ml vízben feloldottuk. Az oldatot liofilizáltuk és 105 mg kivánt hatóanyagot kaptunk. 25 Az igy kapott 105 g poralaku terméket 5 ml 0,2 m ammóniaoldatban (pH = 4,7) feloldottuk. Az oldatot átfolyattuk 2,0 cm x 80 cm "Sephadex G-75" oszlopon, melyet 0,2 m ammóniumacetátoldattal (pH = 4,7) pufferoltunk, majd óránként 30 12 ml-es átfolyási sebességgel az említett pufferoldattal eluáltuk a hatóanyagot. A kapott eluátumból 4 ml-es frakciókat fogtunk fel. A frakciók biológiai értékmérését patkányon végeztük, és azt találtuk, hogy az eluátum a 65. frakciótól a 85. frakcióig 35 terjedő része tartalmazott hatóanyagot. Ezeket a frakciókat összegyűjtöttük, csökkentett nyomáson betöményitettük, majd liofilizáltuk, és 24 mg poralaku termék formájában kaptuk a kivánt hatóanyagot (melynek hatáserőssége 98 E/mg). 3. példa: 120 g szivburokhártyát, melyet kb. 1000 angolna 45 (Anguilla rostrata) szivéből a myocardium-rész eltávolítása utján kaptunk, ugy víztelenítettünk, hogy 5 órán át 20 mg EDTA-t tartalmazó 11 metanolban áztattuk 5 C°-on. Ezt a víztelenítési müveletet 3-szor megismételtük. A víztelenített terméket 50 ugy zsírtalanítottuk, hogy 2 órán át 800 ml kloroformban áztattuk 5 C°-on. Ezt a zsirtalanitási müveletet kétszer megismételtük. A zsírtalanított terméket ismét víztelenítettük a fenti módon, azonban ugy, hogy 1 1 acetont alkalmaztunk, és ezt a 55 víztelenítési müveletet 3-szor megismételtük. A víztelenített terméket levegőn száritottuk és 36 g száritott terméket kaptunk. A fenti eljárással kapott 36 g száritott terméket 500 g karbamid és 18,0 cisztin 1,2 1 0,2 n sósav-60 val készített oldatával 3 órán át extraháltuk szobahőmérsékleten, keveréssel. A keveréket a szilárd fázis elkülönítése céljából 15 percen át percenként 9000 fordulattal centrifugáltuk. Az elkülönített szilárd anyagot a fenti extraháló oldószer 500 ml-es 65 részletével mostuk, és a mosófolyadékot egyesitet-6