162135. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a polimixinekből származó ciklusos polipeptidek előállítására
13 162135 14 metanol-dioxán oldatban oldjuk, és az oldatot kovasavgéloszlopon (magassága 70 cm, átmérője 1,8 cm) kromatograf áljuk. 95:5 térfogatarányú metanol-dioxán eleggyel eluálunk, és 25 ml-es frakciókat gyűjtünk. Ily módon ciklo-[Ny-L-a,y-diaminobutiril-N}'-(N-oxido-3-piridil-metoxi-karboinil)-L-a,y~diamino'butiiril-D-femlalanil-L-leucil-Ny-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)-L-a,y-dia:minobutiril-Nj/-(N-oxido-3-piridil-me t oxikar bon il) -L-a, j'-di aminobutiril-L-treonil]-t kapunk. Az ebben a példában használt 6 pH-ra pufferolt oldat a 18. példában leírt módon készül, és az enzim titerének definíciója azonos a 18. példában megadottal. Rf = 0,27 (kovasavgélen, 50:20:6:24 térfogatarányú n-butanol-piridin-ecetsav-víz eleggyel). 21. példa 55 mg penta-N-(N-oxido-4-piridil-metoxikarbonil)-ikolisztijnnak a 16. példában leírt módon 12 ml 6 pH-ra pufferolt oldattal (készül a 18. példában leírt módon) készült oldatához 12 mg B. subtilis THE 4 által termelt proteázt adunk, és a reiakciókeveréket 20 C°-on 2l / 2 óra hosszat keverjük. Rögtön ezután a reakciót megakasztjuk az oldat pH-ját n sósav hozzáadásával 3 éráltalános képletű vegyülettel való reagáltatásával — ez utóbbi képletben Rí az aminoosoportot védő, hidrogenolízisre labilis csoportot, például benziloxifearbonilcsoportot vagy egy II általános képletű csoportot jelent, R2 pedig a karbonilfunkciót aktiváló, a peptidkémiában használatos csoportot, például a megfelelő hidrazidból salétromsavval kapott azidocsoportot jelent —. A védőcsoportok kiküszöbölése után a fermentációval kapott polimixin Ei-gyel azonos termékhez jutottunk. 22. példa 63 mg N2 -6-metil-oktanoil-Ny-benziloxikarbonil-L-cr,)/-diaminobutiril-L-treonil-Ny-benzil-oxikarbonil-L-a^-diaminobutirilhidrazidnak [készül K. Vogler és munkatársai módszere szerint, Helv. Chim. Acta 48, 1161 (1965)] 1,6 ml ecetsav és 0,178 ml n sósav elegyével készült, 0 C°-ra hűtött oldatához hozzáadunk 6,2 mg nátriumnitritet 0,1 ml desztillált vízben oldva. 0 C°-on való 20 perces keverés után a reakciókeveréket 20 ml jeges desztillált vízbe öntjük. A képződött fehér csapadékot 0 C°-on szűréssel eltekre beállítva. A — 70 C°-ra hűtött reakciókeveréket liofilizáljuk. A maradékot 4 ml metanolban oldjuk, és az alsó részében 5 g kovasavgélt és a felső részében 5 g alumíniumoxidot tartalmazó oszlopon (az oszlop átmérője 10 mm, magassága 30 cm) kromatograf áljuk. 95:5 térfógatarányú metanol-dioxán eleggyel eluálunk, és 4 ml-es frakciókat gyűjtünk. A 8—11. frakciókat egyesítjük, majd 15 torr nyomáson 50 C°on szárazra pároljuk. Így 10 mg ciklo-INy-L-a,}'-diammobutiril-Ny-(N-oxido-4-piridil-metoxikarbonil)-L-cr,y-dimainobutiril-D-leucil-L-leucil-Nj'-(N-oxido-4-piridil-metoxikarbonil)-L-cr,)'-diaminobutiril-N}'-(N-oxido-4--piridil-metoxikarbonil)-L-<7,j/-diaminobutiril-L-t-treonil]-t kapunk. Rf — 0,24 (kovasavgélen, 50:20:6:24 térfogatarányú n-butanol-piridin-ecetsav-víz rendszerben). Az I általános képletű termékek szerkezetét és az eljárás hatékonyságát kimutattuk oly módon, hogy az I általános képletű termékekből ismert polimixineket állítottunk elő, amelyeket eddig fermentálással készítettek. Előállítottunk például kolisztin A^nak is ne^ vezett polimixin Ej-et egy I általános képletű terméknek — ebben a képletben Y — Z D-leucint, illetve L-leucint jelent, G pedig az N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil-csoportot jelenti — egy választjuk, és 20 ml jeges desztillált vízzel mossuk. Ezt a csapadékot hozzáadjuk 100 mg ciklo-[Ny-L-tf,y-diaminobutiril-Ny-(N-oxido-3-piridil-metoxi-karboml)-L-a,y-diaminoíbutiril-D-leucil-L-leucil-N^-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbornl)-L-a,y-diaminobutiril-Ny-(N-oxido-3--piridil-metoxikarbonil)-L-a,)/^diaminobutiril-L-treonil]-nak (készült a 17. példa szerint) 5 ml dimetilformamiddal készült jéghideg oldatához. 2 C°-on való 20 órai állás után a reakciókeveréket 0,3 torr nyomáson 60 C°-on szárazra pároljuk. Az így kapott olajat 20 ml éterben oldjuk, mire csapadék keletkezik. Ezt szűrőre viszszük, és 2 ízben 10—10 ml vízzel mossuk. 0,3 torr nyomáson 20 C°-on megszárítva 106 mg ciklo-[Na-(N-6-a-metil-aktanoil-Nj'^benzoilkäribonil-L-a^-diaminobutiril-L-treoinil-Ny-benziloxikairbonil-L^cf,y-diaiminobutiril)-N5'-L-a,7--diaminobutiril-Nj'-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)-L-a,y-diam:inobutiril-D-leuciil-L-leucil-Nj'-ÍN-oxido-S-piridil-metiloxikarbonil)-L-a,>'-diíaminobutiril-Nj/-(N-oxido-3-piridil-metiloxikarboni^-L-a^-diaiminöbutiril-L-treonil]-t kapunk. Rf = 0,51 (kovasavgélen, 50:20:6:24 térfogatarányú n-buta,nol-piridin*ecetsav-víz rendszerben). 5 10 15 20 25 30 h -CO 40 45 50 55 60 65 NHRi CH3 NHRt I I I CH3 (CH2 ) 2 CHOH (CH2 ) 2 I I I I C2 H 5 —CH--(CH 2 ) 4 — CO—NH—CH—CO—NH—CH—CO—NH—CH—CO—R2 7
