162041. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a kallikrein-tripszininhibitor acil-származékainak előállítására
3 162041 4 A találmány szerinti ¡új vegyületek éppen olyan jól elviselihetők, mint a kallikrein-tri.'»szin-inihibitor. Az új vegyületeknek lényeges előnye az, 'hogy a vesében ¡kismértékben halmozódnak fel és ennek következtében hoszszantartó magas vértükörszintet eredményeinek. Az új vegyületek ezenkívül a vizelettel kiválasztódnak és ezen tulajdonságuknál fogva igen értékesek az urogenitális rendszer betegségeinek kezelésére. A vegyületek egyébként azonos aktivitást mutatnak, mint maga a 'kal- 1 i k re i n- tr ipszin-inhibi tor. Ezt az aktvitást gátlási- (vagy inbibitálási-) egységekben mérjük, melynek jelölése a következőkben: IE. Egy IE 1 mg tripszin aktivitásgátló hatásának felel meg, N-a-benzoil-DL-arginin-p-nitroaniliddel, mint szubsztrátummal mérve, a következő standard-körülményék között: 3 ml össz-ténfogat hőmérséklet 25 C° 1 cm-es küvetta 1 mg szubsztrátum 1 ml deszt. vízben 10 mE tripszin 0,001 n sósav-oldatban + x ml inhibitor oldat 3,0 ml-re kiegészítve 0,2 mólos trietanolamin-pufferrel, PH 7,8, + 0,02 mól kalciumklorid. Az új vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy előbb a kallikrein-tripszin-inhibitort önmagában ismert módon enzimmel, 'például tripszinnel, kallikrein-tripszin-inhibitor-enzim-kopmlex vegyületté alakítjuk [Chauvet és Acher, J. Bioi. Chemistry 242, (1967), 4274 oldal]. Ezt a komplexet ezután az előbbiekben megadott acilezőszerekkel reagáltatrjuk. Az így kapott acil-kállikrem-tripszin-Lnhibitor-koaniplexből az enzimet önmagában ismert módon léhasítjuk (lásd az előtbbi irodalmat). Ezzel a módszerrel a kaliikrein-tripszin-mhibitor acil-származékát viszonylag tisztán kapjuk. Az anyagot célszerű azonban az önmagában ismert tisztítási módszereknek alávetni, mint amilyenek például a gél-szűrés, vagy ioncserélő-kromatográfia. Ebben az eljárásban a .kallikrem-tripszininhiíbitor és az enzim közötti kötés létesítése, majd később az enzim lehasítása azért szükséges, hogy a kaUikrein-tripszin-irthibitor reaktív centrumát az acilezéstől megvédjük. A 'kallikrem-tripszin-inűiibitor találmány szerinti acil-származékai a gyógyászatban ugyanazon esetekben kerülhetnek felhasználásra, mint amilyenekben a kallikrein-tripszin-inhibitort már évek óta eredményesen alkalmazzák. A felhasználás módjai és az alkalmazott dózisok megfelelnek annak, amelyek már a kallikrein-tripszin-inhibitomál .ismerték. 50 mg kallikrein-tripszin-inhibitort és 188 rag tripszint 30 ml, jéggel hűtött (0 C°) 0,1 mólos nátriumhidrogén'kanboniátHpuffenben oldunk, melyet 2 n nátriumhidroxiddal 8,5 pH-ra állítunk be. Az oldathoz kis mennyiségiben annyi- trijpszint, ül. kallitorein-tripszm-inhibitort adunk, míg a 0,05 ml-es minta tripszingátló aktivitást már nem mutat. Az így kapott kallikreiin-tripszin-inlhilbitor-tripszin-komplex oldatát két óra hosszat állni hagyjuk (0 °C), majd 0,5 finoman porított maleinsavanhidridet adunk hozzá és 2 n nátriumhidroxid oldat folyamatos hozzáadásával a pH értékét 8,5-ön tartjuk. Misiden elszappanosítási reakció részletének végén — mely a nátronlúgfelhasználás erős visszaeséséről ismerhető fel -- további 0,5 g maleinsavanhidódet adunk, vagyis négy részletben összesen 2 g-ot. Az utolsó maleinsavanhidirid-részlet hozzáadása után, amikor a pH értéke állandó marad, az oldat 6 mólos végkoncentrációjáig 18,5 g karbamidot adunk az oldathoz és 2 n sósavval a pH értékét 1,9-re állítjuk Ibe, mely savanyításnál a maleinsav és a módosított tripszin egy része kiválik. A módosított tripszin teljes kicsapására a 0 C°-ra lehűtött szuszpenzióiba 2,5 g ammóniumszuifátot adunk. A csapadékot ezután hűtés közben centrifugáljuk, az így kapott tiszta oldatot dekantáljuk, 2 ml 0,2 mólos trietanolamin-puffert i(pH 7,8) adunk hozzá és 2 n nátriumhidroxid oldattal semlegesítjük, (pH 7—8). A tetrai(maleoil)-kallikreki-tripszin-inhiibitor mellett kis mennyiségű maleinsavat és módosított kallilkrein-tripszin-inhibitor-tripszin-komplexet tartalmazó semleges oldatot Sephadex G—50 oszlopon vezetjük át, melyet előzőleg 0,02 mólos ammóniumacetát-pufferrel pH 6,0^ra állítottunk be. A molekulanagyság szerinti frakcionálási az előbbi puffer-rel, mint eluálószerrel végezzük. A tetra(maleoil)-kallikrein-tripszin-iwhibitort tartalmazó oldatot forgónvákuumbepárlóban 20 °C-os vízfürdő hőmérsékletén lob. 5 ml-re be-, töraényítjük, majd Bio-gél-Pi2 oszlopon. sómentesítjük, melynél eluálószerként desztillált vizet alkalmazunk. A tetra(maleoil)-kallikrem-tripszin-inhibitor sómentes frakcióját liofilizáljuk. Termelés: a felhasznált természetes kallikrein-tripszin-jinhibitor mennyiségére vonatkoztatva a liofilizált tetrai(maleoil)-kallikrein-tripszin-inhibitor termelése 84%-os, fajlagos aktivitása 3,3 lE/mg. .2. példa: Az 1. példában megadott eljárás szerint a kallikrein-tripszin-inhibitor-tripszm-komplex reakciójához fele mennyiségű maleinsavanihidridet alkalmazva a tri(maleoil)-kallikrein-tripszin-inhibitort állítjuk elő, mely mellett még 1. példa: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
