162041. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a kallikrein-tripszininhibitor acil-származékainak előállítására
Termelés: a felhasznált természetes kalhkrein-tripszin-inhi'bitor mennyiségére vonat-162041 0 tetra(inaleoil)-kállifcrein-tripszÍ!n-inhibitor is képződik. Sephadex G—'50 oszlopon gél-szűréssel végzett frakcionálás után a reakció-termék 300—500 y keverékét cellulózacetát fóliára öntjük, melyet 0,05 mólos iborát-pufferrel 5 (pH 8,0) átitattunk. Az eléktróferogram futási ideje 6 V/om feszültségnél 1 óra. Két sávot kapunk, melyet a természetes kallikrein-tripszin-inlhibitor futási-távolságához viszonyítva és 1,0-nak véve, a tetrai(maleoil)-kalli- 10 krein-triipszin-inhibitorra 0,56 és a tri(maleoil)-kallikrein-tripszin-inhibitorra 0,64 futási távolságot kapunk. Preparatív elektraforézissel, pl. poliakrilamid-géllel, mint hordozóanyaggal a kallikrein-tripszin-inhibitor mindkét származó- 15 ka a legjobb eredménnyel állítható elő. Termelés: a felhasznált természetes kallikrein-tripszm-inhiibitor mindkét származéka a legjobb eredménnyel állítható elő. Termelés: a felhasznált természetes kallikrein-tripszin-inhilbitor (mennyiségére vonatkoztatva a liofilizált anyag termelése 88%-os, fajlagos aktivitása 3,3 IE/mg. A tetra- és a tri(maleoil)-kallikrein-tripszin-inhibitor viszonya 2/3 : 1/3. 5 3. példa: 200 mg kallikrein-tripszm-inhibitort és 715 30 mg tripszint 50 ml jéggel hűtött puffer oldatban oldunk és az 1. .példában leírt módon a kallikrem-tripszin-mhibitor-tripszin-kompiexet állítunk elő. Az így kapott oldathoz 2 g borostyánkősavanhidridet négy részletben hoz- 35 záadva tetra(szukcinil)-kallikrein-tripszin-inhibitort kapunk. A módosított tripszin arnmóniumszulfáttal végzett kicsapás után a csapadékot szűrjük és a szűrletet 8 n nátriumhidroxiddal pH 6,5-re állítjiuk be. Az oldatot 0,01 40 mólos ecetsavval beállítjuk és Sephadex G—50 oszlopra öntjük. Az eluáló szer 0,01 mólos ecetsav. A tetrai(szukcinil)-kallüorein-tripszininhiibátort tartalmazó frakciót liotfilizáljuk. Termelés: a felhasznált természetes kai- 45 likrein-tripszin-inhi'bitor mennyiségére vonatkoztatva (töblb kísérlet szerint) a liofilizált tetra(szukcinil)-kaUikrein-tripszm-inhibátor termelése 80—90%, faijlagos aktivitása 3,3—3,7 IE/mg. 4. példa: 200 mg kallikrein-tripszin-inhibitort az 1. példában megadott eljárás ¡szerint 7.15 mg tripszinnel kaUikrem-tripszin-inhiibitor-tripszin-koimplex oldattá alakítjuk. A komplex oldatát négy részletben hozzáadott, összesen 2 g aicetilmerkaptolbarostyánkősavainhidriddel re- 60 agáltatjuk, majd az így kapott tetra-, tri-, di- és mono{acetilmerkaptoszukcinil)-kallikrein-tripszin-inihibitor keverékét az ismert módon elektraforézissel. komponenseire választjuk szét. koztatva a liofilizált anyag termelése 80%. fajlagos aktivitása 3,3—13,7 IE/mg. 5. példa: 50 mg kallikrein-tripszin-inhibitort és 183 mg tripszint az 1. példában megadott módon reagáltatva, a kaUikrein-tripszin-inhiibito>r-tripszin-komplexet állítjuk elő. A komplex oldatához négy részletben összesen 2 g karboxi■metilmerkaptoborostyánkősavanhidridet adunk. Az adagolás befejezése után karbamidot adunk az elegythez és 2 n sósavval pH 2,0-ra savanyítjuk, majd triklórecetsavval a reakcióelegy végkoncentrációját 3%-ra állítjuk be. A kicsa- 20 pódó módosított tripszint szűrjük, és a szürletet 8 n nátriumhidroxiddal pH 6,5-re állítjuk ibe. Az oldatot ezután Sephadex G—50 oszlopon engedjük át, melyet előzőleg 0,01 mólos ecetsavval beállítottunk, majd kormatografál- 25 jük és a módosított kallikrein—tripszm-inhibitort a 2. példában leírt módszer szerint cellulózacetát-tfólián végzett elektroforézissel a tét— ra(ikarboximetilmerkaptoszukcinil)-kallikrein-tripszin-inhibitort és . tri(karboxknetilmerkaptoszukcinil)-kallikren-tripszin-inhiibitort elválasztjuk. Termelés: a felhasznált természetes kallikrein-tripszin-infhiíbitar mennyiségére vonatkoztatva a liofilizált tetra- és trii(karboxiimetilmerkaptoszukcinil)-kallikrein-tripszin-inhibitor termelése 65%, fajlagos aktivitása 3,3—3.7 IE/mg. S. példa: 50 mg természetes kallikrein-tripszin-inhiibitor, 190 mg tripszin és 15 ml 0,1 mólos nátriumhidrogénkarbonát-puffer oldatát (pH 8,5), 7,5 ml acetoniban jól elkevert 50 mg 1-dimetilaminonaiftalinJ5-szulifonilkloriddal 18 óra hosszat 20 °C-on reagáltatunk. A reakcióele- 50 gyet ezután 2 n sósavval pH 2,0-re savanyítjuk és triklórecetsav hozzáadásával a végkoncentrációt 3%-ra állítjuk ibe. Rövid ideig tartó állás után a módosított tripszint szűrjük, a szűrletet hígított hangyasavval pH 2-re állít- 55 jiuk be és Sephadex G—50 oszlopon engedjük át. Hangyasavivál (pH 2,0) eluáljuk és az l-dimetilammonaftalin-5-szulfonil-kallikrein-tripszin-inhiibitort tartalmazó frakciókat liofilizáljuk. Termelés: a felhasznált természetes kallikrein-tripszki-inlhibitor mennyiségére vonatkoztatva a liofilizált pcli^l’-dimetilaminonaftalin-S-szulfonil)-kallikrein-tripszin-inhibitor terme- 65 lése 35%, fajlagos aktivitása 3,3—;3,7 IE/mg. 3
