162040. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ureidofeniltiokarbamidok előállítására, valamint az azokat tartalmazó fungicidek

A találmány szerinti új vegyületek éppen olyan jól elviselihetők, mint a kallikrein-triiszm-inhibitor. Az új vegyületeknek lényeges előnye az, hogy a vesében kismértékben halmozódnak fel és ennek következtében taoszszantartó magas vértükörszintet eredményeznek. Az új vegyületek ezenkívül". a vizelettel kiválasztódnak és ezen tulajdonságuknál fogva igen értékesek az urogeni tális rendszer betegségeinek kezelésére. A vegyületek egyébként azonos aktivitást mutatnak, mint maga a kallikrein-t^ipsziji-í'nlhiibitar. ,-: Ezt az aktivitást gátlási- i(vagy inhibitálási-) egységekben mérjük, melynek jelölése a következőkben: EE. Egy iIE 1 mg txijpszin. aktivitásgátló hatásának felel meg, N«cHbenzoil-DL-arginin-p-nitroaniliddel, mint szuíbsztrátummal mérve, a következő standard-körülmények között: i3 ml össz-térfogat hőmérséklet 2ö C° 1 cm-es küvetta 1 mg szubsztrátum il ml deszt. vízben + 10 amE tripszin 0,001 n sósav^oldatban + xml inhibitor oldat 3,0 ml-re kiegészítve 0,2 mólos trietanolamin-pufferrel, pH 7,8, + 0,02 mól kalciiumklordd. Az új vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy előbb a kallikrein-tripszin-inhilbitort önmagában ismert módon enzimmel, például tripszinnel, kallikrein-tripszin-inhibitor-enzim-kopmlex vegyületté alakítjuk [Chauvet és Aoher, J. Biol. Chemistry 242, (1967), 4274 oldal]. Ezt a komplexet ezután az előbbiekiben megadott acilezőszerekkel reagáltatjuk. Az így kapott acU-kaUikrein-triipszin-inhibitor-komplexből az enzimet önmagában ismert módon lehasítjuk (lásd az előlbbi irodalmat). Ezzel a módszerrel a kallükrein-tripszin-inihibitor acil-saármazékát viszonylag tisztán kapjuk. Az anyagot célszerű azonban az önmagában ismert tisztítási módszereknek alávetni, mint amilyenek például a gél-szűrés, vagy lioncserélő-kromatográfia. Ebben az eljárásban a kallifcrein-tripszininhilbitor és az enzim közötti kötés létesítése, majd később az enzim lehasítása' azért szükséges, hogy a kallikrein-tripszin-^rMfoitor reaktív eentnuimát az acilezéstől megvédjük. A kallitorein-tripszin-inhibitor találmány szerinti acil-szánmazékai a gyógyászatban ugyanazon esetekben kerülhetnek felhasználásra, mint amilyenekben a kallikrein-tripszin-inhibitort már évek óta eredményesen alkalmazzák. A felhasználás módjai és az alkalmazott dózisok megfelelnek annak, amelyek már a kallikrein-tripszin-inihibitornál ismertek. 1. példa: i50 mg kallikrein-tripszin^inhibitort és 188 mg tripszint 30 ml, jéggel hűtött (0 C°) 0,1 5 mólos nátóurnhidrogénkartbonát-pufferiben oldunk, melyet 2 n nátriumhidroxiddal 8,5 pH-ra állítunk be, Az oldathoz kis mennyiségben annyi', tripszint, ill. kaüikirein-tripszin-inhibitort adunk, míg a 0,05 ml-es minta tripszin-10 gátló aktivitást már nem mutat. Az így kapott kallikrein-tripszin-irfoibitor-tripszin-komplex oldatát két óra hosszat állni hagyjuk (0 °C), majd 0J5 finoman porított maleinsavanhidridet adunk hozzá és 2 n nátriumhidroxid 15 oldat folyamatos hozzáadásával a pH értékét 8,5-ön tartjuk. Minden elszappanosítási reakció részletének végén — mely a nátronlúgfelhasználás erős visszaeséséről ismerhető fel — további 0,5 g maleinsaivanhiidridet adunk, 20 vagyis négy részletben összesen 2 g-ot. Az utolsó omaleinsavanhidrid-részlet hozzáadása után, amikor a pH értéke állandó marad, az oldat ,6 mólos végkonoentrációjáig íl8,5 g karbamidot adunk az oldathoz és 2 n sósavval 25 a pH értékét 1,9-re állítjuk Ibe, mely savanyításnál a maleinsav és a módosított tripszin egy része kiválik. A módosított tripszin teljes kicsapására a 0 C°-ra lehűtött szuszpenzióba 2,5 g ammóniumszuifátot adunk. A csapadé-30 kot ezután hűtés köziben centrifugáljiuk, az így kapott tiszta oldatot dekahtáljuk, 2 ml 0,2 mólos trdetanolaiminjpuiffert |(pH 7,8) adunk hozzá és 2 n nátriumhidroxid oldattal semlegesítjük, ,(pH 7—8). A tetral(maleoil)-kallikreiin-35 -tripszin-inhilbitor mellett kis mennyiségű maleinsavat és módosított kalltoein^tripszin-inhi/bitor-tripszin-komplexet tartalmazó semleges oldatot Sephadex G—50 oszlopon vezetjük át, melyet előzőleg 0,02 mólos aimimónium-40 acetát^pufferrel pH 6,0-ra állítottunk ibe. A molekulanagyság szerinti frakcionálást az előbbi puffer-rel, mint eluálószerrel végezzük. A tetra(maleoil)-kallikrein-tripszin-imhibitort tartalmazó oldatot forgÓHvákuumibepárlóban 20 45 °C-os vízfürdő hőmérsékletén kb. 5 ml-re be-, töményítjük, majd Bio-gél-P-i2 oszlopon sómentesítjük, melynél eluálószerként desztillált vizet alkalmazunk. A tetra(imaleoil)-kallikrein-tripszin-inhibitor sómentes frakcióját liofili-50 záljiuk. Termelés: a felhasznált természetes kallikrein-tripszin^inhiibitor mennyiségére vonatkoztatva a liofilizárt tetrai(maleoil)-kallikrein-55 -tripszin-inhibitor termelése 84%-os, fajlagos aktivitása 3,3 IE/mg. 2. példa: 60 Az 1. példában megadott eljárás szerint a kallikrem-tripszinjinhiibitor-tripszin^konipléx reakciójához fele mennyiségű maleinsavanhidridet alkalmazva a tríi(maleoil)-kallikrein-trip-65 szin-inhifoitort állítjuk elő, mely mellett még 2