161921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-)-cisz-1,2-epoxipropilfoszfonsav előállítására
161921 6 pH 6,8—7,0-re állítjuk be és 121 °C-on 15 percig stérilezzük 1,05 atm-n. A sterilizált táptalajt Streptomyces fradiae NRRL B-3359-cel oltjuk be, amelyet a következő összetételű ferde agáron tenyésztettünk: kukoricakeményítő 1 % (—)-aszparagin 0,1% K2 HP0 4 0,1% agar 2,0% csapvíz q.s A beoltott táptalajt Í2I8 °C-on 220 ford/perc fordulatszámú rázógépen inkubáljuk 48—72 órán át, majd azonnal felhasználjuk, vagy felhasználásig 5 °C-on tároljuk. A kapott inokulumból 1 ml-t hozzáadunk 30 ml fent leírt összetételű steril táptalajhoz, amelyet 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban készítettünk el. Hasonló módon oltottuk be a többi lombikot, amelyekbe ugyanilyen mennyiségű steril táptalajt adtunk, és amelyekhez Millipore szűréssel sterilezett (+)-cisztein.HCl-oldatot adagoltunk. Az (+)-eisztein.HCl végkoncentrációja a táptalajban 500 mg/ml. Az inokulált lombikokat 28 °C-on 4 napon át 220 ford./perc sebességű rázógépen rázattuk. Ezután a sejteket centrifugálással eltávolítjuk és a derített levet pH 8,0-ra beállított 0,05 M trisz-hidroximetilaminometán-pufferrel hígítjuk. A fermentlében termelődött i(—)-icisz-(l,l2^epoxipropilfoiSzfonsav koncentrációját Proteus vulgaris NRRL B—336-tal végzett vizsgálattal határoztuk meg. A következő táblázat (-f-)^cisztein-tartalmú és ennek hozzáadása nélkül kapott fermentlevek antibiotikum-tartalmát mutatja be, három kísérlet alapján. Antibiotikum-tartalom, /tg/ml A kísérlet sorszáma 1 2 3 Adagolás 0 18,3 19,3 12,8 50 /<.g/ml(-|-)-cisztein.HCl 24,8 23,5 24,1 Hasonló eredményeket kaptunk, amikor a Streptomyces fradiae NRRL 13—3359 helyett a Streptomyces fradiae más (—)cisz-l,2-epoxiprc~ pilfoszfonsav-termelő törzseit (például NRRL 3358, 3359 és 3360), Streptomyces viridochromogenest (NRRL 3413, 3414, 3415, 3416 és 3427), vagy a Streptomyces wedmorensis NRRL 3426-t használjuk. A Proteus vulgaris NRRL B—3361 alkalmazásával végzett vizsgálat lefolyása a következő: A vizsgálathoz használt tenyészetet Difco ferde tápagar-tenyészet formájában tartjuk fenn, amely 0,2% Difco élesztőkivonatot tartalmaz. A beoltott ferde agarokat 37 °C-on inkubáljuk 18—24 órán át és 1 hétig tároljuk hűtőszekrényhőmérsékleten. Hetenként friss csöveket készítünk. A próbalemezek inokulumát naponta állítjuk elő olymódon, hogy a ferde agárról lekaparjuk a tenyészetet és azzal —250 ml^es Erlenmeyer-lombikban — beoltunk 50 ml Difco táp-5 levest, amely 0,2% Difco élesztőkivonatot tartalmaz. A lombikot 37 °C-on rázógépen inkubáljuk 18—24 órán át. A férmentlevet ezután 660 m;u. hullámhosszon 40% áteresztésre állítjuk be Bausch & Lomb Spectronic 20 alkal-10 mázasával olymódon, hogy a tenyészethez 0,2%r os élesztőkivonat-oldatot adagolunk. A be nem oltott fermentlevet vakpróbaként használjuk ehhez a megoldáshoz. A beállított tenyészetből 30 ml-t használunk fel 1 táptalaj beol-15 tására. Vizsgálati táptalajként Difco tápagart használunk, amely 0,2% élesztőkivonatot tartalmaz. Ezt a táptalajt elkészítjük, autoklávban steri-20 lezzük és 50 °C-ra hagyjuk hűlni. A táptalaj beoltása után 10 ml-t adunk 1—1 steril Petricsészébe és a közeget megszilárdulni hagyjuk. A vizsgálandó felülúszó folyadék mintáit 25 0,05 M pH 8,0 trisz-pufferrel megfelelő koncentrációra hígítjuk. Az agarlemez felületén 8 mm belső átmérőjű hengereket helyezünk el; egy lemezen rendszerint minden mintához 3 hengert veszünk. Három hengert e mintákkal 30 szemben helyezünk el és ezeket standard oldattal töltjük meg, amely 1,5 /tg/ml szabad (—)cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsavat tartalmaz. A lemezeket 37 °C-on 18 órán át inkubáljuk és meghatározzuk a zóna-átmérőket mm-ben. A 35 standard oldat feltisztulási zónája 16,5—19 mm között változik különböző napokon, ezért minden kísérletsorozatnál standard görbét veszünk fel, majd nomogram segítségével meghatározzuk a minta hatóértékét. 40 2. példa: Ha az 1. példa szerinti eljárást oly módon is-45 metéljük meg, hogy (4-)-«:isztein helyett 500 ,"g (± )-fhomociszteint veszünk, a kapott ferimentievek vizsgálatával a következő táblázatban bemutatott értékeket kapjuk: 50 Antibiotikum-tartalom, i/tg/ml 1. kísérlet 2. kísérlet Adagolás 55 0 15,9 12,8 500 /Jbgfcnl (±)-homocisztein 20,1 19,3 Hasonló eredményeket kapunk, ha S. fradiae 60 NRRL 13—3359 helyett a Streptomyces fradiae más (—)cisz-l ,2-epoxipropilf oszf onsav-termelő törzseit (NNRL 3358, 3359 és 3360), Streptomyces viridochromogenest (NRRL 3413, 3414, 3415, 3416 és 3427) vagy Streptomyces wedmorensis 65 NRRL 3426-t használunk. 3
