161732. lajstromszámú szabadalom • Eljárás korrinvázas vegyületek fenol-formaldehid gyantakomplexeiből történő kinyerésére
9 161732 10 6. példa 110 g száraz és porított, fermentációból fenolformaldehid gyantával leválasztott B^-koenzimfenol-formaldehid gyantakomplexhez, mely öszszesen 180 mg Bj2-koenzimet tartalmaz, fénytől védett körülményeik között 440 mii leoldó folyadékot adunk. A leoldó folyadék 532 ml jégecettel 4,2 pH értékre állított deszt. víz és 133 ml aceton elegyéből áll. Ebből 440 ml-t öntünk a rózsaszínű csapadékhoz. Két óráig tartó keverés után szívószűrőre öntjük és a szűrőn maradt anyagot a maradék oldószerrel átmossuk. A szűrletként nyert sötétvörös oldatban, térfogatéra számított 40 súly°/o kb. 260 g ammonszulfátot oldunk, majd az oldatot választótölcsérbe öntjük. Az alsó színtelen vizes oldatot leengedjük, a felső kb. 200 ml acetonos oldathoz pedig 100 ml toluolt öntünk. Összerázás után a korrinoidok az újonnan kivált alsó vizes fázisba mennek át. A felső szerves oldószeres fázist kevés vízzel összerázzuk, majd a vizes kivonatokat egyesítjük és 50 C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten csökkentett nyomáson kb. 80 ml térfogatra bepároljuk. A koncentrátum Bi2-koenzim tartalma papírkromatográfiás mennyiségi meghatározás szerint 162 mg. A meghatározást a British Pharmacopoeia 1968 „Hydroxocobalamin" c. cikkelyében (475. oldal) szereplő, „Coloured impurities" cím alatt leírt módszer szerint végezzük, az azonosítása pedig a Biochem. Prepns, 10, 27 (1963) szerint történik. 7. példa 7,10 g száraz és porított, kromatográfiás elválasztásból fenol-formaldehid gyantával leválasztott Bi2-feoenzim fenol-formaldehid gyantakomplexhez, mely összesen 990 mg B12 -koenzimet tartalmaz, fénytől, védett körülmények között 35 mii acetont adunk. Fél óráig tartó keverés közben az aceton a komplexből a gyantát kioldja. Ezután a keveréket szívószűrőre öntjük, majd a szűrőpapíron visszamaradó rózsaszínű kovaföldet acetonnal mossulk. A mosást addig ismételjük, amíg a kezdetben sötétbarna szűrlet színtelen nem lesz. A Bi2-koenzim tartalmú kovaföldet levegő átszívatással megszárítjuk. Azután kb. 60 ml deszt. vízzel — továbbra is fénytől védett körülmények között — a kovaföldről a Bi2-koenzimet leoldjuk. Ha a lecsepegő szűrlet utolsó része még színes lenne, úgy a mosást kevés deszt. vízzel színtelenedésig tovább folytatjuk. A tömény vizes oldatot rázótölcsérben 2X21 ml 1:2 térfogatarányú fenol-kloroform eleggyel kivonatoljuk, majd az .alsó szerves oldószeres fázis leengedése után 12 ml 1:4 térfogatarányú fenol-kloroform eleggyel újból összerázzuk. A B12--koenzimet ezáltal mennyiségileg a szerves oldószer elegybe vittük át. Ezután 56 ml kloroformot, 60 ml acetont, és 25 ml deszt. vizet adunk az elegyhez és összerázzuk. Rövid idő múlva az elegy két fázisra válik szét. A felső vizes fázis töményen tartalmazza a hatóanyagot. A két fázis elválasztása után az alsó szerves oldószeres fázist 25 ml deszt. vízzel újiból kivonatoljuk. Az egyesített vizes kivonatokat — továbbra is fénytől védett körülmények között — szálmentesre szűrjük, majd az edényzetet 10 ml deszt. vízzel átmossuk. A vizes oldathoz 480 'ml acetont adunk, éjjelen át a jégszekrényben állni hagyjuk: másnapra apró tűs ikristályok válnak ki. A kristályokat zsugorított üvegszűrőn összegyűjtjük, kevés acetonnal mossuk, majd levegő átszívatásával szárítjuk. Nedvességtartalmát — továbbra is fénytől védett körülmények között — 12%-ot meg nem haladó értékre állítjuk, Nyeredék: 805 mg kristályos B12 -koenzim. Meghatározását a British Pharmacopoeia 1968 „Hydroxocobalamin" c. cikkelyében (475. oldal) szereplő, „Coloured impurities" cím alatt leírt módszer szerint végezzük, az azonosításra pedig a Biochem. Prepns. 10, 27 (1963) szerint történik. 8. példa 63,0 g száraz és porított, kromatográfiás elválasztásból fenol-formaldehid gyantával leválasztott hidroxokobalamin-fenol-formaildehid gyantakomplexhez, mely összesen 9,135 g hidroxokobalamint tartalmaz, fénytől védett körülmények között 190 ml 1:2 térfogatarányú előzőleg vízmentesített fenol-kloroform elegyet adunk. Fél óráig tartó keverés közben a komplex a fenölkloroform elegyben túlnyomórészt feloldódik. A keveréket szívószűrőre öntjük, majd a viszszamaradó szilárd anyagot, mely szűrési segédanyagként szerepel, leszivatás után újból elkeverjük 190 ml 1:2 térfogatarányú, előzőleg vízmentesített fenol-kloroform eleggyel. Űjibóli leszívatás után a szűrőn maradt szilárd anyagot 100 ml 1:4 térfogatarányú, ugyancsak vízmentesített fenol-kloroform eleggyel mossuk át. A szűrleteket egyesítve rázótölcsérbe Öntjük, majd 250 ml vízmentes kloroformmal a szűrőről és a szívópaladkból ugyancsak a rázótölcsérbe mossuk a maradók színedéket. A kb. 480 ml 1:4 térfogatarányú fenol-kloroform oldatot összerázzuk 240 ml 0,05 n HCl oldattal. Az alsó szerves oldószeres fázist leengedjük, majd a savas vizes fázist 50 ml 1:4 térfogatarányú fenol-kloroformmal rázzuk össze, hogy a visszamaradó színezéket eltávolítsuk a vizes fázisból. Az egyesített sötétvörös színű fenoMdoroformos oldathoz 340 ml kloroformot, 180 ml deszt. vizet és 640 ml acetont adunk. Összerázás után az elegy két fázisra válik szét. A felső vizes fázis elválasztása után az alsó szerves oldószeres fázist újból kivonatoljuk 100 ml desz. vízzel. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
